胸腺素原體內(nèi)抑制小鼠肝癌細(xì)胞H22的研究①

蔡報(bào)偉 栗 華 韓 偉 王世媛 張 亭 劉升發(fā) 周克夫

(廈門(mén)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院環(huán)境與生態(tài)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)和腫瘤細(xì)胞工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廈門(mén)361005)

根據(jù)Parkin等［1］報(bào)道，2000年全球新發(fā)癌癥病例為1 010萬(wàn)例，死亡620萬(wàn)。在 Ferlay等［2］報(bào)道中最常見(jiàn)的癌癥中致死率排列第三是肝癌。在我國(guó)肝癌的死亡率占全部惡性腫瘤死亡的18.8%，僅次于胃癌［3］。因此，尋找和篩選有效的抗肝癌藥物是目前醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)。

胸腺素α原(Prothymosinα，ProTα)是胸腺素α1(Tα1)的前體蛋白，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中廣泛分布，在淋巴組織及非淋巴組織均可找到。在細(xì)胞外，ProTα通過(guò)潛在的膜受體調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，促進(jìn)IFN-γ、TNF-α、IL-2等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答。研究表明，ProTα能夠有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)荷瘤小鼠的壽命［4］。本研究開(kāi)展從中國(guó)健康人外周血淋巴細(xì)胞克隆表達(dá)的重組人ProTα對(duì)抑制小鼠肝癌細(xì)胞株H22的體內(nèi)研究，為今后開(kāi)展腫瘤藥物的研究和應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 H22腫瘤株(小鼠肝癌)由廈門(mén)大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心保種。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為雄性昆明小鼠，SPF級(jí)，購(gòu)自廈門(mén)大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。重組人前胸腺α原由本實(shí)驗(yàn)室和廈門(mén)伯賽基因轉(zhuǎn)錄技術(shù)有限公司共同制備。

1.2 方法

1.2.1 重組ProTα干預(yù) 將小鼠隨機(jī)分為A、B、C、D、E組，每組各5只，A組預(yù)先腹腔注射等體積的生理鹽水作為空白對(duì)照組，B組預(yù)先腹腔注射ProTα，7.5 ng/g;C組預(yù)先腹腔注射ProTα，12.5 ng/g;D組預(yù)先腹腔注射ProTα，25 ng/g;E組預(yù)先腹腔注射 ProTα，50 ng/g。共預(yù)先腹腔注射9次，隔一天注射一次。

1.2.2 H22腹水型荷瘤小鼠模型制備 無(wú)菌條件下將購(gòu)買(mǎi)的H22腹水腫瘤按1∶8稀釋計(jì)數(shù)，然后調(diào)整濃度為 3 ×107ml－1，以 100 μl/只，每只接種 H22的細(xì)胞數(shù)為3×106個(gè)/只，接種于小鼠的腹腔，觀察并記錄小鼠的存活情況，隔天記錄小鼠體重。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 記錄各組死亡時(shí)間，數(shù)量，根據(jù)數(shù)據(jù)，采用 GraphPad Prism5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05為顯著差異，P＜0.01為極顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 預(yù)先用藥組和對(duì)照組小鼠的存活情況差異比較 經(jīng)過(guò)觀察記錄，A對(duì)照組小鼠在腹腔注射H22后第13天開(kāi)始出現(xiàn)死亡 ，第22天全部死亡，而用藥組B組，第20天才開(kāi)始出現(xiàn)死亡，到第34天才最后全部死亡;C、D、E組分別是30、31、34天全部死亡，結(jié)果說(shuō)明ProTα對(duì)H22腫瘤具有明顯抑制效果。

圖1可以看出A組和B組平均生存時(shí)間有顯著性差異(P＜0.05)，相對(duì)于A組，B組小鼠平均生命明顯延長(zhǎng)，C組、D組、E組的平均生存時(shí)間也較A組要長(zhǎng)，但延長(zhǎng)時(shí)間沒(méi)有明顯的差異(P＞0.05)，所以我們可以得出ProTα用藥量為7.5 ng/g時(shí)效果最明顯。

2.2 預(yù)先用藥各組和對(duì)照組小鼠的體重變化比較

各組小鼠接種H22后，體重隨時(shí)間變化情況見(jiàn)表1。從表1中我們可以看出用藥組B體重在第5～7天開(kāi)始明顯比對(duì)照組A小，差異顯著(P＜0.05)，第9天后，B、C、D組和對(duì)照組出現(xiàn)了極顯著性差異(P＜0.01)，而E組和對(duì)照組比較沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)。此外，我們發(fā)現(xiàn)ProTα的用藥量在7.5～12.5 ng/g時(shí)，對(duì)本實(shí)驗(yàn)小鼠腹水抑制作用效果更明顯。

圖1 各組小鼠平均存活天數(shù)Fig.1 The average survival time of mice in each group

表1 不同時(shí)間各組小鼠平均體重差異情況Tab.1 The average body weight of mice in each group at different times

3 討論

有研究報(bào)道外源注射重組ProTα可以有效提高免疫系統(tǒng)的免疫能力［5］。注射ProTα?xí)鰪?qiáng)小鼠體液免疫和細(xì)胞免疫［6］。已經(jīng)被證明大鼠的ProTα在小鼠感染Candida albicans后具有免疫保護(hù)作用［7］。Pan等［8］認(rèn)為這種免疫保護(hù)作用和生物體釋放遷移抑制因子(MIF)有關(guān)，ProTα能刺激單核細(xì)胞釋放轉(zhuǎn)移抑制因子(MIF)，其作用比Thymosinα1強(qiáng)10～20倍。胸腺素α原可以明顯延長(zhǎng)大部分白血病模型DBA/2小鼠的存活期，對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射胸腺素α原后，具有能夠增強(qiáng)腹膜內(nèi)巨噬細(xì)胞的殺瘤作用，提高NK細(xì)胞、LAK細(xì)胞的活性，并誘導(dǎo)IL-2和TNF-α的產(chǎn)生，因此能夠在免疫防御反應(yīng)中起關(guān)鍵性的作用［9］;同時(shí)胸腺素α原激活腫瘤特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞(CD8+)和輔助性T細(xì)胞(CD4+)的特異性抗腫瘤作用，有利于延長(zhǎng)患有腫瘤的小鼠壽命［10，11］。Skopeliti等［12］最近發(fā)現(xiàn)，在凋亡細(xì)胞中，胸腺素α原被caspases切割產(chǎn)生的多個(gè)C末端的片段，具有刺激外周血單核細(xì)胞增殖、自體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)、自然殺傷(NK)淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞活性，促使胞內(nèi)穿孔素產(chǎn)生，上調(diào)粘附分子和CD25的表達(dá)以及淋巴細(xì)胞活化等免疫調(diào)節(jié)活性。

我們通過(guò)原核表達(dá)獲得高純度的重組ProTα，經(jīng)過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明具備天然 ProTα的生物活性［13，14］。本研究以小鼠肝癌細(xì)胞株為對(duì)象，研究該重組ProTα對(duì)腹水型H22的抑制效果。通過(guò)體內(nèi)抑制腫瘤實(shí)驗(yàn)，證明該重組蛋白能夠有效抑制小鼠H22細(xì)胞在體內(nèi)繁殖，減少腹水含量，降低小鼠癥狀，明顯延長(zhǎng)小鼠生存時(shí)間，其中重組蛋白劑量在7.5 ng/g時(shí)效果最明顯。這個(gè)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致［15］。通過(guò)探究該重組蛋白的體內(nèi)生物活性，為今后開(kāi)展抗腫瘤藥物篩選提供新的途徑。有關(guān)該重組ProTα的抑制腫瘤生長(zhǎng)的生物活性機(jī)理目前正在研究中。

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