ABCG2單抗聯(lián)合NPs-PTX體外抑制MM CSCs作用初探①

楊翠萍 熊 非 竇 駿 劉云婧 陳峻崧 顧 寧

(東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)系，南京210009)

迄今，有很多化療藥物用于多發(fā)性骨髓瘤(MM)治療，由于MM細(xì)胞表現(xiàn)出對常規(guī)化療藥物的顯著耐藥性，因此，MM仍然被認(rèn)為是不可治愈的疾病。如不進(jìn)行治療，進(jìn)展期MM患者的中位生存期僅為6個(gè)月［1］。推測主要原因可能是MM中有極小比例的癌干細(xì)胞(CSCs)，具有自我更新、無限增殖及多向分化的能力，是MM形成、進(jìn)展、復(fù)發(fā)及耐藥根源［2，3］。常規(guī)化療藥物由于沒有瞄準(zhǔn) MM CSCs，故治愈率低。因此，尋找高效低毒的藥物抑制MM CSCs，仍是MM研究的重點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上［2］，通過免疫磁珠分離法 (MACS)分選出 CD138－CD34－細(xì)胞(MM CSCs)［3，4］，運(yùn)用 ABCG2單克隆抗體(McAb)聯(lián)合納米紫杉醇(Nanoparticles Paclitaxed，NPs-PTX)在體外對人MM CSCs的抑制作用進(jìn)行了初步研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1．1 藥物 Fe3O4NPs-PTX(通過物理吸附方法制備)，由東南大學(xué)納米科學(xué)與技術(shù)研究中心提供，用滅菌注射用水配成4 mg/L溶液。紫衫醇(PTX)注射液購自四川太極制藥有限公司，產(chǎn)品批號:11010002，用滅菌注射用水配成40 mg/ml溶液。

1．2 細(xì)胞株與抗體 NCI-H929、RPMI8226細(xì)胞購自中國科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心;小鼠抗人CD138、CD34單抗購自德國 Miltenyi Biotec公司，人ABCG2單抗購自美國eBioscicence公司。

1．3 主要試劑與儀器 RPMI1640粉劑(美國Gibco公司);新生胎牛血清(杭州四季青);Transwell板(德國Corning Costar公司);CCK-8試劑盒，細(xì)胞周期檢測試劑盒，細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物);流式細(xì)胞儀(FCM，美國BD公司);酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司);倒置顯微鏡(日本 Olympus公司)等。

1．4 方法

1．4．1 細(xì)胞培養(yǎng) NCI-H929、RPMI8226細(xì)胞用含10%胎牛血清的 RPMI1640培養(yǎng)液置37℃、5%CO2、飽和濕度條件下常規(guī)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，每2～4天傳代一次。

1．4．2 分選 CD138－CD34－MM 細(xì)胞(MM CSCs)按照Miltenyi Biotec公司MACS操作流程獲得MM CSCs。

1．4．3 CCK-8 法檢測 ABCG2 McAb 聯(lián)合 NPs-PTX對MM CSCs增殖的影響 取對數(shù)生長期細(xì)胞，用含有10%滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105ml－1，接種于96孔培養(yǎng)板，分為空白組、對照組、McAb組、PTX組、NPs-PTX組及McAb聯(lián)合NPs-PTX組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。以培養(yǎng)液作為空白組，以不加任何藥物的細(xì)胞懸液作為對照組，McAb 組 加 入 ABCG2 抗 體 2 μl/100 μl(1∶50)，PTX 組加入 40 mg/ml PTX 溶液，NPs-PTX組加入4 mg/L的NPs-PTX，McAb聯(lián)合NPs-PTX組加入 ABCG2 McAb 2 μl/100 μl(1∶50)，再加入 4 mg/L的 NPs-PTX，充分混勻。每孔總體積為100 μl，分別處理12、24、36、48、72 小時(shí)，然后加入 CCK-8溶液10 μl，置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2小時(shí)，在酶標(biāo)儀450 nm處，讀取吸光度值(A)。生長抑制率=(對照組光吸收值－給藥組光吸收值)/對照組光吸收值 ×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1．4．4 ABCG2 McAb聯(lián)合NPs-PTX 對MM CSCs遷徙能力的影響 選擇孔徑為8 μm的Transwell板，分為對照組、McAb組、PTX組、NPs-PTX組及McAb聯(lián)合NPs-PTX組，各組上室加細(xì)胞105/100 μl及相應(yīng)的藥物，下室加含10%FBS 1640細(xì)胞培養(yǎng)液600 μl。37℃培養(yǎng)24小時(shí)后，收集下室細(xì)胞并計(jì)數(shù)，觀察各組細(xì)胞的遷徙能力。

1．4．5 Annexin V/PI 雙染檢測細(xì)胞凋亡 參照Annexin V細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書操作。取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105ml－1，接種于6孔培養(yǎng)板，對照孔僅加細(xì)胞;McAb組加入ABCG2 抗體2 μl/100 μl(1∶50)，PTX 組加入40 mg/ml PTX溶液，NPs-PTX組加入 4 mg/L的 NPs-PTX，McAb 聯(lián)合NPs-PTX 組加入 ABCG2 McAb 2 μl/100 μl(1∶50)，再加入4 mg/L的NPs-PTX，充分混勻。每孔總體積為1 ml，24小時(shí)后收獲細(xì)胞，收集1×106個(gè)細(xì)胞，預(yù)冷的 PBS液洗滌2次，將細(xì)胞重懸于500 μl Annexin V 結(jié)合緩沖液，再加入 5 μl碘化丙啶(PI)，避光室溫反應(yīng)10分鐘，立即用FCM檢測，CellQuest1．2分析軟件分析結(jié)果。

1．4．6 FCM檢測細(xì)胞周期 參照細(xì)胞周期檢測試劑盒說明書操作。取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105ml－1，接種于6孔培養(yǎng)板，分組及各組的干預(yù)措施同凋亡檢測。每孔總體積為1 ml，24小時(shí)后取5×105個(gè)細(xì)胞，用冷PBS洗滌1次，用1ml PBS重懸細(xì)胞，緩慢逐滴將細(xì)胞懸液滴入等體積的冰乙醇中(終濃度為70%)，4℃過夜。用PBS洗滌2遍后再重懸細(xì)胞;加入 RNaseA 2μl，輕輕吹勻，37℃孵育45分鐘;加入100 μl PI，使終濃度為200 μg/ml，4℃孵育15分鐘，F(xiàn)CM 檢測。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS13．0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，對數(shù)據(jù)進(jìn)行常規(guī)方差齊性檢驗(yàn)、正態(tài)性檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 ABCG2 McAb聯(lián)合NPs-PTX對MM CSCs增殖抑制的影響 與McAb組、PTX組相比，NPs-PTX及McAb聯(lián)合 NPs-PTX對 NCI-H929、RPMI8226細(xì)胞CSCs均有顯著性抑制作用(P＜0．05);與NPs-PTX組(55%)比較，McAb聯(lián)合NPs-PTX對MM CSCs抑制作用有顯著性抑制作用(P＜0．05)，對NCI-H929細(xì)胞增殖抑制率達(dá)70%，對RPMI8226細(xì)胞達(dá)到80%，見圖1A、B。

2．2 ABCG2 McAb聯(lián)合NPs-PTX對MM CSCs遷徙能力的影響 與對照組(5．5%)相比，McAb(3.25%)組、PTX 組(2．0%)、NPs-PTX 組(1．7%)及McAb聯(lián)合NPs-PTX組(0．6%)對 RPMI8226細(xì)胞CSCs的遷徙能力均有顯著性抑制作用(P＜0.05);與 McAb組比較，PTX組、NPs-PTX組及McAb聯(lián)合NPs-PTX組對MM CSCs遷徙有顯著性抑制作用(P＜0．05);與NPs-PTX組比較，McAb聯(lián)合NPs-PTX組對MM CSCs遷徙有顯著性抑制作用(P ＜0．01)，見圖2。

2．3 ABCG2 McAb聯(lián)合NPs-PTX誘導(dǎo)MM CSCs凋亡 McAb、PTX、NPs-PTX及McAb聯(lián)合NPs-PTX均可誘導(dǎo)RPMI8226 CSCs早期凋亡，與對照組比較，差異有顯著性(P＜0．05);NPs-PTX與 PTX誘導(dǎo)RPMI8226 CSCs早期凋亡差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05);McAb 聯(lián)合 NPs-PTX(43．15%)誘導(dǎo) MM CSCs早期凋亡的能力較NPs-PTX(18．35%)有極顯著性差異(P ＜0．01)，見圖3。

2．4 ABCG2 McAb聯(lián)合NPs-PTX對MM CSCs細(xì)胞周期的影響 與對照組比較，McAb組、PTX組、NPs-PTX組及McAb聯(lián)合NPs-PTX組均能影響 NCIH929 CSCs的細(xì)胞周期，且差異有顯著性(P＜0.05);NPs-PTX組與PTX組相比較，其影響細(xì)胞周期的差異有顯著性(P＜0．05);與NPs-PTX比較，McAb聯(lián)合NPs-PTX對NCI-H929 CSCs細(xì)胞周期的影響，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)，見圖4。

圖1 McAb聯(lián)合NPs-PTX抑制NCI-H929 CSCs和RPMI8226 CSCs的增殖Fig．1 McAb in combination with NPs-PTX inhibited the proliferations of NCI-H929 CSCs and RPMI8226 CSCs in vitro

圖2 McAb聯(lián)合NPs-PTX抑制RPMI8226 CSCs的遷徙Fig．2 McAb in combination with NPs-PTX inhibited the migration of RPMI8226 CSCs in vitro

圖3 藥物誘導(dǎo)RPMI8226 CSCs早期凋亡Fig．3 McAb in combination with NPs-PTX induced early apoptosis of RPMI8226 CSCs in vitro

圖4 藥物對NCI-H929 CSCs細(xì)胞周期影響Fig．4 McAb in combination with NPs-PTX influenced on the cells cycle of NCI-H929 CSCs in vitro

3 討論

紫杉醇(Palitaxel，PTX，商品名為Taxol)最初是從紫杉樹皮中分離提取的具有高效抗腫瘤活性的天然植物藥，主要作用于微管和微管蛋白系統(tǒng)，可促進(jìn)微管蛋白裝配成微管，但抑制微管的解聚，影響細(xì)胞有絲分裂而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。目前臨床上使用的紫杉醇助溶劑聚羥已基蓖麻油乙醇具有心臟毒性、刺激血管、過敏等不良反應(yīng)，此外，紫杉醇溶解性差，生物利用度低，尋找新型的紫杉醇制劑是目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。Fe3O4納米粒子粒徑為10納米左右，比表面積大，偶聯(lián)容量高，正被用于靶向藥物載體(Targeted drug delivery，TDD)［5，6］。它能夠通過增強(qiáng)的通透與維持作用，將藥物靶向輸送到MM CSCs內(nèi)。因此，本文選用的Fe3O4納米紫杉醇可有效的避免上述缺點(diǎn)，靶向治療MM CSCs。

MM CSCs富含 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-binding cassette transporter，ABC)，ABCG2 是其中主要成員之一。ABCG2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有藥泵功能，可將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的藥物排出細(xì)胞外，逃避藥物殺傷作用。ABCG2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可被抗ABCG2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的抗體阻斷，從而使其失去部分活性［7］。為此，我們選用針對耐藥泵ABCG2的McAb聯(lián)合NPs-PTX在體外觀察對MM CSCs的抑制作用，期望為下一步在體內(nèi)能對MM CSCs發(fā)揮抑制功效提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，進(jìn)而為根治MM提供新策略。

本研究發(fā)現(xiàn)，ABCG2 McAb聯(lián)合 NPs-PTX對NCI-H929 CSCs的增殖抑制率為70%，而對 RPMI8226 CSCs的抑制率高達(dá)80%。我們前期實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明(資料未顯示)，RPMI8226細(xì)胞ABCG2的表達(dá)水平比NCI-H929要高得多，這與有關(guān)報(bào)道一致［8］。因PRMI8226細(xì)胞表面有較高的ABCG2蛋白表達(dá)，應(yīng)用ABCG2 McAb后，可部分阻斷ABCG2藥泵作用，藥物可充分在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，因此，達(dá)到較高的增殖抑制作用。RPMI8226 CSCs細(xì)胞遷徙實(shí)驗(yàn)表明，對照組遷徙率為5．5%，ABCG2 McAb聯(lián)合 NPs-PTX組為0．6%，而 NPs-PTX組是1．7%。其機(jī)理可能與McAb對ABCG2分子的封閉作用有關(guān)［7］。

此外，本實(shí)驗(yàn)用 McAb聯(lián)合 NPs-PTX對 MM CSCs的抑制作用進(jìn)行了研究，并對其細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響作了初步探討。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，單抗聯(lián)合NPs-PTX可有效誘導(dǎo)RPMI8226 CSCs早期凋亡，凋亡率達(dá)到43．15%，與McAb、NPs-PTX比較，差異有顯著性(P＜0．05)。而PTX與NPs-PTX對RPMI8226 CSCs早期凋亡的誘導(dǎo)能力差異不大，這可能與藥物作用濃度及細(xì)胞種類有關(guān)。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，隨著藥物濃度的改變，細(xì)胞的早期凋亡率也發(fā)生變化［9］。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)表明ABCG2 McAb聯(lián)合NPs-PTX能使MM CSCs增殖停滯在G期，并發(fā)生G/M期阻滯。近來研究發(fā)現(xiàn)PTX還可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞ABCG2與相應(yīng)抗體 5D3 識別和結(jié)合［10，11］，這可能是導(dǎo)致 ABCG2 McAb聯(lián)合 NPs-PTX能使 MM CSCs發(fā)生細(xì)胞周期阻滯的原因所在。另外本研究還發(fā)現(xiàn)ABCG2 McAb聯(lián)合NPs-PTX對NCI-H929 CSCs細(xì)胞周期的影響與NPs-PTX組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。這可能與ABCG2 McAb本身對細(xì)胞周期沒有影響以及NCI-H929細(xì)胞CSCs相對RPMI8226 CSCs含有較低水平的ABCG2蛋白有關(guān)。

綜上所述，ABCG2 McAb聯(lián)合NPs-PTX具有體外抑制人MM CSCs作用，其機(jī)制可能與其通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，發(fā)生細(xì)胞周期阻滯有關(guān)，其詳細(xì)機(jī)制尚待進(jìn)一步深入研究。

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