HPLC法測(cè)定薏苡仁不同炮制品中5-羥甲基糠醛及糠醛的含量*

張令志 1，吳 皓2，李 偉 2，文紅梅2，崔小兵 2**

1江蘇宿遷市食品藥品檢驗(yàn)所，宿遷 223800；2南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 210029

薏苡仁，禾本科植物薏苡（Coix lacryma-jobi L.）的干燥成熟種仁[1]?！侗静菥V目》列為上品，性涼，味甘、淡。健脾滲濕，除痹止瀉。麩炒焦香，糠醛又稱麩醛，具有明顯的焦香味。按照中醫(yī)理論，薏苡仁炒焦產(chǎn)生焦香味，有健脾作用，但未見科學(xué)的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。根據(jù)現(xiàn)代藥物化學(xué)和藥理學(xué)研究證明，炒焦產(chǎn)生的黃色葡萄糖經(jīng)熱轉(zhuǎn)化而成具有毒副作用的5-羥甲基糠醛。所以《中國(guó)藥典》對(duì)葡萄糖輸液等規(guī)定了5-羥甲基糠醛的限量（比色法）。為了進(jìn)一步全面研究5-羥甲基糠醛的健脾作用和毒副作用，首先要建立一個(gè)比較精確的含量測(cè)定方法。本文首次通過(guò)HPLC法比較了薏苡仁生品、薏苡仁麩炒品、薏苡仁清炒品中5-羥甲基糠醛及糠醛含量的變化，通過(guò)測(cè)定5-羥甲基糠醛及糠醛含量，可為薏苡仁炮制提供了一個(gè)客觀的評(píng)價(jià)方法，為焦香健脾理論提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

waters-2695液相色譜儀，PDA檢測(cè)器。

1.2 藥品與試劑

5-羥甲基糠醛及糠醛對(duì)照品（均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為111626-201007、110709200304）；樣品，薏苡仁經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)王春根教授鑒定為禾本科植物薏苡（Coix lacryma-jobi L.）的干燥成熟種仁。

甲醇為色譜純，其它試劑為分析純；水為二次蒸餾水。

1.3 樣品制備

樣品依據(jù)中藥炮制的相關(guān)理論。本實(shí)驗(yàn)將薏苡仁加工為清炒薏苡仁、麩炒薏苡仁。每種炮制方法各平行炮制3份。

清炒薏苡仁:稱取適量干凈薏苡仁，置燒熱的平底鍋中，用文火加熱，炒至深黃色，有香氣，取出放涼。

麩炒薏苡仁:稱取適量麥麩（每100g薏苡仁，用麥麩15 g），置燒熱的平底鍋中，炒至冒煙，放入干凈薏苡仁，不斷翻炒，炒至深黃色，篩去麩皮，薏苡仁和麩皮放冷備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:welchrom C18（250 mm×4.6 mm）；流動(dòng)相:甲醇-0.5%醋酸水溶液（5∶95）；檢測(cè)波長(zhǎng):276 nm；流速:1.0 mL·min-1，柱溫:35℃，進(jìn)樣:10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液

精密稱取對(duì)照品5-羥甲基糠醛7.5 mg，用20%甲醇定容至10 mL；對(duì)照品糠醛7.5 mg，用20%甲醇定容至100 mL；分別制得對(duì)照品儲(chǔ)備液，再吸取上述兩儲(chǔ)備液各1 mL，加20%甲醇定容至50 mL，配制成 5-羥甲基糠醛 15 μg·mL-1、糠醛 1.5 μg·mL-1的對(duì)照品混合溶液。

2.2.2 供試品溶液

稱取麩炒薏苡仁樣品細(xì)粉約0.5 g，精密稱定，置10 mL量瓶中，加20%甲醇8 mL，超聲處理30 min，加20%甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取上述混合對(duì)照品溶液 0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、2.4 mL 置于 10 mL量瓶中，加入20%的甲醇水溶液定容至10 mL。按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程分別為:5-羥甲基糠醛 Y=7.986×104X+1685.7，r=0.9999；糠醛 Y=3.196×104X+107.44，r=0.9998。表明 5-羥甲基糠醛在 0.15～3.6 μg·mL-1、糠醛在 0.015～0.36 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得5-羥甲基糠醛糠、糠醛峰面積，其RSD值分別為0.28%、0.35%。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批麩炒薏苡仁樣品，平行6份，按“2.2.2”項(xiàng)制備，平行測(cè)定兩次，結(jié)果5-羥甲基糠醛和糠醛含量的RSD分別為0.98%、1.06%。表明該方法重復(fù)性好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份麩炒薏苡仁供試品溶液，在 1、2、4、8、12、24 h 分別進(jìn)樣，每次進(jìn)樣 10 μL，測(cè)得5-羥甲基糠醛、糠醛峰面積對(duì)數(shù)的RSD分別為0.21%、0.40%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 回收率試驗(yàn) 精密稱取麩炒薏苡仁樣品5份，每份約0.25 g，再精密加入對(duì)照品儲(chǔ)備液0.2 mL（5-羥甲基糠醛 15 μg·mL-1、糠醛 1.5 μg·mL-1），按照“2.2.2”供試品溶液制備加樣回收樣品溶液，分別進(jìn)樣，每次進(jìn)樣10 μL，測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果5-羥甲基糠醛、糠醛的平均回收率分別為98.76%、100.84%，RSD分別為1.51%、1.32%。結(jié)果見表 1、表 2。

表1 麩炒薏苡仁中5-羥甲基糠醛加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=5）

表2 麩炒薏苡仁中糠醛加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=5）

2.3.6 樣品的含量測(cè)定 薏苡仁不同樣品按“2.2.2”項(xiàng)制備，取10 μL進(jìn)樣，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量，平行3份，每份進(jìn)樣2次。結(jié)果見表3，色譜圖見圖1。

表3 薏苡仁不同炮制品中5-羥甲基糠醛及糠醛的含量測(cè)定（n=5）

圖1 薏苡仁不同炮制品色譜圖

3 討 論

3.1 色譜條件的選擇

比較了甲醇-水、甲醇-0.5%HOAc等不同系統(tǒng)和比例的流動(dòng)相。先后采用甲醇-水（10∶90），甲醇-水（5∶95），甲醇-0.5%HOAc（8∶92），甲醇-0.5%HOAc（7∶93），甲醇-0.5%HOAc（6∶94），甲醇-0.5%HOAc（5∶95）的流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明，以甲醇-0.5%HOAc（5∶95）為流動(dòng)相，能達(dá)到滿意的分離效果，且操作簡(jiǎn)便。

3.2 樣品提取條件的選擇

稱取樣品0.5 g，置于10 mL量瓶中，加入不同濃度的甲醇水溶液定容至10 mL（20%、40%、50%、70%），超聲不同的時(shí)間（15、30、45、60 min），結(jié)果表明20%甲醇、提取時(shí)間30 min基本提取完全。

3.3 薏苡仁不同炮制品中5-羥甲基糠醛及糠醛的含量分析

根據(jù)中醫(yī)藥理論，麩炒焦香健脾，糠醛具有明顯的焦香味。由結(jié)果可見，炒薏苡仁中5-羥甲基糠醛含量為生薏苡仁的7倍,糠醛含量為生薏苡仁的2倍，說(shuō)明加熱可促進(jìn)5-羥甲基糠醛、糠醛的產(chǎn)生；麩炒薏苡仁中5-羥甲基糠醛含量為生薏苡仁的31倍，糠醛含量為生薏苡仁的6倍，說(shuō)明加熱以及麥麩都可促進(jìn)5-羥甲基糠醛、糠醛的產(chǎn)生，而5-羥甲基糠醛、糠醛是麩炒過(guò)程中麥麩發(fā)生梅拉德反應(yīng)（麥麩中糖與氨基酸）的產(chǎn)物。本文以5-羥甲基糠醛、糠醛含量來(lái)評(píng)價(jià)薏苡仁的不同炮制品，可以很好的控制其質(zhì)量。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:353.