乙型肝炎病毒X基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建

李曉斐

(青島市傳染病醫(yī)院檢驗(yàn)科 山東 青島 266033)

乙型肝炎是一種高發(fā)傳染病，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染后有5% ～10%的患者將發(fā)展為慢性肝炎(chronic hepatitis，CH)，而這又是肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)發(fā)生的高危險(xiǎn)因素(幾率比正常人大100倍)[1-2]。HBV基因具有4個(gè)開(kāi)放式閱讀框架(open reading frame，ORF)，其中X基因是最小的開(kāi)放式閱讀框架，位于第1374～1835位核苷酸之間，全長(zhǎng)462bp，編碼154個(gè)氨基酸，為相對(duì)分子質(zhì)量17000的X蛋白。目前認(rèn)為HBx是一種多效轉(zhuǎn)錄激活因子，其本身不能與雙鏈DNA直接結(jié)合，而是通過(guò)蛋白與蛋白之間的相互作用來(lái)行使功能。HBx基因是HBV復(fù)制和擴(kuò)散所必需的基因，在乙肝慢性化和HCC的發(fā)生中具有重要作用[3-4]。

為了進(jìn)一步研究X基因的生物學(xué)特性及其與HCC發(fā)生的關(guān)系，我們構(gòu)建了HBV X基因的真核表達(dá)載體，并在真核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。

材料和方法

一、材料

乙型肝炎患者血清采自青島市傳染病醫(yī)院門(mén)診及住院患者。DH5α由青島市傳染病醫(yī)院檢驗(yàn)科保存，HepG2細(xì)胞由青島大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng);pcDNA6(+)質(zhì)粒購(gòu)自Invitrogen公司;多聚乙烯酰胺(PEI)購(gòu)自Sigma公司;dNTP、Taq酶、T4連接酶、EcoRⅠ、HindⅢ、100 bp DNA Marker購(gòu)自上海生物工程公司;鼠抗人HBV X一抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗購(gòu)于晶美生物工程公司;Western Blot試劑盒購(gòu)自 RPL公司;RPMI 1640和胎牛血清購(gòu)自Gibco公司;引物由上海生物工程公司合成提供。

二、方法

1.真核表達(dá)載體pCDNA6(+)-HBx的構(gòu)建

(1)血清HBV DNA提取:100 μL血清加入300 μL TES液混勻，60℃消化1 h，等體積苯酚/氯仿及氯仿抽提各1次，上清加入2倍體積無(wú)水乙醇及1/10體積3 mol/L醋酸鈉(pH值4.8)沉淀病毒DNA，再以70%乙醇漂洗1次，并溶于20μL滅菌雙蒸水中;(2)PCR擴(kuò)增X基因:引物設(shè)計(jì)，擴(kuò)增X基因片段。用 Primer引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行軟件設(shè)計(jì)，分別在上游引物和下游引物5'端添加限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)，根據(jù)載體校正讀碼框，保證終止密碼正常讀碼，并于引物兩端加入相應(yīng)數(shù)目保護(hù)堿基。所設(shè)計(jì)引物如下:primer1:5'-GTA TAA GCT TAC CAT GGC TGC TAG GC-3';Primer 2:5'-TGA AGA ATT CGA TCT CAG TGG TGG T-3'。在25μL反應(yīng)體系中加入2.5μL 10 × 反應(yīng)緩沖液，0.5μL 1 mmol/L dNTP，HBV DNA 模板 1.0 μL，兩引物各 0.5 μL，Taq 酶0.2 μL，MgCl 21.8 μL，補(bǔ)水至25 μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3 min，94℃變性60 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s，40個(gè)循環(huán)，72℃再延伸 10 min。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定;(3)載體pcDNA6(+)-HBx構(gòu)建:將 PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒pcDNA6(+)用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳，回收約500 bp目的基因片段與pcDNA6(+)質(zhì)粒片段，用T4連接酶連接，構(gòu)建載體pcDNA6(+)-HBx，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)含有目的基因片段，再經(jīng)測(cè)序進(jìn)一步鑒定。

2.重組質(zhì)粒的表達(dá)及鑒定 (1)細(xì)胞培養(yǎng):轉(zhuǎn)染前16 h將HepG2細(xì)胞(5×104/mL)接種于6孔板中，置37℃、5%CO2，10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng);(2)細(xì)胞轉(zhuǎn)染:設(shè)空白對(duì)照組、pcDNA6(+)空質(zhì)粒對(duì)照組和 pcDNA6(+)-HBx實(shí)驗(yàn)組。吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液，加入無(wú)血清16401 mL/孔，再加入C液100 μL。37℃培養(yǎng)箱放置1 h后，每孔加入 110 μL胎牛血清，37℃、5%CO2培養(yǎng)24h～48h，分別收集細(xì)胞和上清液;(3)Western Blot鑒定X蛋白表達(dá)取轉(zhuǎn)染后48 h瞬時(shí)表達(dá)細(xì)胞，消化后于試管內(nèi)離心，去上清，用PBS洗滌2次，加入十二烷基磺酸鈉(SDS)上樣緩沖液，100℃煮沸3 min，冷卻后進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳及Western Blot檢測(cè)表達(dá)蛋白。

3.Western Blot鑒定X蛋白表達(dá) 取轉(zhuǎn)染后48h瞬時(shí)表達(dá)細(xì)胞，消化后于試管內(nèi)離心，去上清，用 PBS洗滌2次，加入 SDS上樣緩沖液，100℃煮沸3 min，冷卻后進(jìn)行SDS-PAGE電泳及Western Blot檢測(cè)表達(dá)蛋白。

結(jié) 果

一、X基因真核載體的構(gòu)建

1.PCR擴(kuò)增X基因 PCR擴(kuò)增后，電泳可見(jiàn)約500 bp處有一明顯條帶，見(jiàn)圖1。

圖1 HBx基因瓊脂糖電泳結(jié)果

2.HBx基因表達(dá)載體 pcDNA6(+)-HBx的雙酶切鑒定 重組質(zhì)粒pcDNA6(+)-HBx經(jīng)HindⅢ、EcoR I雙酶切，出現(xiàn)2個(gè)片段，大片段與pcDNA6空質(zhì)粒遷移率接近，小片段位于 DNA Mark約500 bp處，與X基因大小一致。測(cè)序結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pcDNA6(+)-HBx含有完整的正確的X基因片段。見(jiàn)圖2。測(cè)序結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pcDNA6(+)-HBx含有完整的正確的X基因片段。

二、真核表達(dá)載體 pcDNA6(+)-HBx在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)

將pcDNA6(+)-HBx和pcDNA6(+)分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48 h做Western Blot，pcDNA6(+)-HBx轉(zhuǎn)染組在17000處出現(xiàn)了陽(yáng)性條帶，而在pcDNA6(+)轉(zhuǎn)染組與HepG2細(xì)胞對(duì)照組沒(méi)有陽(yáng)性條帶。表明所構(gòu)建的真核表達(dá)載體pcDNA6(+)-HBx可以在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。見(jiàn)圖3。

圖2 HBx基因瓊脂糖電泳結(jié)果

圖3 HepG2細(xì)胞表達(dá)X蛋白Western Blot結(jié)果

討 論

乙型肝炎是嚴(yán)重威脅人類健康的世界性傳染病。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報(bào)道，我國(guó)乙型肝炎表面抗原陽(yáng)性患者人數(shù)在1.2億以上，每年因HBV感染致死的人數(shù)有100萬(wàn)左右[5]。HBx基因表達(dá)產(chǎn)物X蛋白具有多種生物功能，可通過(guò)與多種轉(zhuǎn)錄因子間的相互作用，發(fā)揮對(duì)多種病毒和細(xì)胞因子的激活作用，如原癌基因(c-myc、N-myc等)、轉(zhuǎn)錄因子(AP-1，NF-κB 等)、HBV 增強(qiáng)子等;也可激活RAS、Fas L、STAT-3及MAKP/JAK途徑等，在HCC的發(fā)病過(guò)程中起核心作用[6-7]。X蛋白不僅是一種復(fù)雜的反式激活因子，而且可通過(guò)影響正常的細(xì)胞周期，干擾DNA的修復(fù)，調(diào)節(jié)肝細(xì)胞增殖、分化和凋亡等，其影響細(xì)胞凋亡[8-9]的作用是通過(guò)參與多條信號(hào)傳導(dǎo)通路發(fā)揮的。關(guān)于X蛋白在細(xì)胞凋亡中的作用，目前有兩種截然相反的觀點(diǎn)，一種觀點(diǎn)認(rèn)為X蛋白可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，另一種觀點(diǎn)認(rèn)為其可抑制細(xì)胞凋亡。Lee等[10]發(fā)現(xiàn) HBx可以影響宿主的免疫功能。同時(shí)，由于HBV感染的宿主專一性很強(qiáng)，因此，大大限制了我們對(duì)肝炎、肝癌的研究和防治。利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，我們便可將其轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中穩(wěn)定、持續(xù)地表達(dá)，在體外細(xì)胞水平上了解并分析X基因的表達(dá)及其產(chǎn)物的生物學(xué)功能。我們的研究利用基因重組技術(shù)構(gòu)建了HBx基因的真核表達(dá)載體pcDNA6(+)-HBx，并篩選到了穩(wěn)定表達(dá)X蛋白的 HepG2細(xì)胞，表明 HBx基因表達(dá)載體pcDNA6(+)-HBx可在真核細(xì)胞中表達(dá)，為進(jìn)一步研究HBx蛋白在肝癌發(fā)生中的致病作用奠定了前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

HBX蛋白引發(fā)的促或抗凋亡作用可能因其作用不同階段和不同細(xì)胞環(huán)境而異?，F(xiàn)在的許多研究結(jié)果僅是針對(duì)不同的細(xì)胞株和不同的HBX分子伴侶，而且未能完全考慮到HBX在不同時(shí)空上的差異。加上多細(xì)胞機(jī)體的信號(hào)調(diào)節(jié)系統(tǒng)是復(fù)雜多樣的，研究者也僅能在相對(duì)理想的條件下獲得結(jié)果。因此，HBX蛋白對(duì)機(jī)體細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用和確切機(jī)制還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

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