枯草芽孢桿菌WL17產(chǎn)抗菌物質對魚丸的保鮮作用

南 楠，戚向陽，袁勇軍

(1.華中農業(yè)大學食品科技學院，湖北武漢430070;2.浙江萬里學院生物與環(huán)境學院，浙江寧波315100)

枯草芽孢桿菌WL17產(chǎn)抗菌物質對魚丸的保鮮作用

南 楠1，戚向陽2，*，袁勇軍2

(1.華中農業(yè)大學食品科技學院，湖北武漢430070;2.浙江萬里學院生物與環(huán)境學院，浙江寧波315100)

為了研究抗微生物肽在水產(chǎn)制品保鮮方面的應用，該文探討了枯草芽孢桿菌WL17產(chǎn)抗菌肽對魚丸貯藏過程中菌落數(shù)、硫代巴比妥酸值(Thiobarbituric acid，TBA)、揮發(fā)性鹽基氮值(Total volatile basic nitrogen，TVB-N)、硬度、彈性和咀嚼性的影響。結果表明:當抗菌物質添加濃度為2mg/g時，可使魚丸的菌落數(shù)下降1.23個數(shù)量級，TBA值和TVB-N處于較低水平，而其質構特性沒有大的變化，且與乳酸鏈菌肽(Nisin)的保鮮效果相當。結果表明枯草芽孢桿菌WL17產(chǎn)抗菌物質對魚丸具有較好的保鮮效果。

枯草芽孢桿菌WL17，抗菌物質，魚丸，保鮮

Abstract:In order to guide the application of antimicrobial substances from Bacillus subtilis WL17 in the preservation of aquatic products，effects of adding different concentrations of antimicrobial substances obtained from Bacillus subtilis on the bacterial count，TBA value，TVB-N value，hardness，springiness，cohesiveness of fishball during storage process were studied.Results showed that antimicrobial substances at a concentration of 2mg/g caused 1.23lg cfu/g reduction of the microbial count，whereas the TBA value and TVB-N value were both at the low-level with no significance texture change of fish-ball.The experiments showed the preservation effect on the fish-ball after adding 2mg/g antimicrobial substance was the same as nisin，which indicated the antimicrobial substance obtained from Bacillus subtilis had a good preservation effect on fish-ball.

Key words:Bacillus subtilis WL17;antimicrobial substance;fish-ball;preservation

隨著我國速凍行業(yè)的快速發(fā)展，備受人們喜愛的魚丸制品的需求量不斷增加，但由于魚丸制品蛋白含量高、營養(yǎng)豐富，在貯藏的過程中極易腐敗變質。有研究顯示魚丸在4℃左右冷藏的保質期一般在一周左右［1-2］。采用高壓滅菌或凍藏保鮮不但會導致魚丸組織構造的破壞，而且會增加企業(yè)的能耗成本。因此，使用生物保鮮技術不失為一種好的選擇，目前我國允許使用的天然生物保鮮劑只有乳酸鏈菌肽(Nisin)和納他霉素(Natamycin)兩種，已經(jīng)廣泛應用于食品的防腐保鮮［3-6］。由于生物保鮮物質在達到防腐保鮮目的的同時，還不會造成食品的毒素污染，而且有些生物保鮮劑本身就是食品中的某種營養(yǎng)成分。因此，開發(fā)高效安全的天然食品防腐劑已成為食品添加劑發(fā)展的主要方向。在前期的研究中，我們發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌WL17代謝合成的抗菌物質對食品致病菌和腐敗菌都有很好的抑制效果，本研究將進一步探討抗菌物質對新鮮魚丸的保鮮效果，為其在實際生產(chǎn)中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鰱魚及輔料 沃爾瑪超市;枯草芽孢桿菌WL17本實驗室保存;Nisin 分析純，浙江銀象生物工程有限公司;2-硫代巴比妥酸 分析純，上海卓康生物科技有限公司;營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、蛋白胨及酵母膏分析純，杭州微生物試劑有限公司;牛肉膏 分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

BILON-8型均質機 上海比朗;CT3型質構儀美國Brookfield公司;SPX型智能生化培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠;754型紫外可見分光光度儀 上海菁華科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 魚丸的制作工藝 鮮鰱魚→洗凈→采肉→漂洗→脫水→精濾→排斬→調料→成型→水煮→冷卻→包裝

輔料配方(g):魚肉100，取食鹽3，淀粉20，砂糖2，味精 0.8，水30。

1.2.2 枯草芽孢桿菌WL17抗菌活性物質的制備取斜面菌種一環(huán)到種子培養(yǎng)基(牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉 5g，酵母膏 5g，葡萄糖 5g，蒸餾水1000mL，pH=7.0～7.4)中，37℃，160r/min，培養(yǎng) 18h后，按照3%的接種量接入裝有100mL發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖11g，MgSO40.5g，L-谷氨酸鈉 5g，KCl 0.5g，KH2PO41.0g，F(xiàn)eSO40.15mg，MnSO45.0mg，CuSO40.16mg，蒸餾水1000mL，pH=6.91)的500mL 三角瓶中，28℃，160r/min，發(fā)酵培養(yǎng)32h。發(fā)酵液在4℃下離心15min(8000r/min)去菌體得到上清液，上清液用6mo1/L的HCl調pH為2.5，4℃下沉淀1h。然后以10000r/min的轉速低溫離心15min，收集沉淀物，用70%甲醇溶解提取三次，收集提取液并將其pH調為中性，旋轉蒸發(fā)除去甲醇后真空冷凍干燥可得到粗提物，分析表明其對食品常見致病菌和腐敗真菌具有較好的抑菌活性。

1.2.3 抗菌物質對魚丸保鮮效果的研究 在魚丸制作過程中添加不同含量的抗菌物質，使其最終濃度分別為 0、0.5、1.0、2.0、3.0mg/g，另外將添加 0.3mg/g nisin的魚丸作為陽性對照組。魚丸制成后立即用無菌食品保鮮袋密封包裝，將樣品放置于4℃下儲藏，定期對魚丸的細菌總數(shù)、TBA值、TVB-N值、硬度、彈性和咀嚼性指標進行檢測。檢測隨機抽3袋，結果取平均值。

1.2.4 細菌總數(shù)的測定 在無菌操作臺內，稱取樣品10g，置于90mL無菌生理鹽水中，充分均質后，做成1∶10的稀釋液，按GB 4789.2-2010規(guī)定的方法進行稀釋平板計數(shù)。

1.2.5 硫代巴比妥酸值(TBA)的測定［7］取10g樣品斬碎均勻后，加50mL 7.5%的三氯乙酸(含0.1%EDTA)，振搖30min，雙層濾紙過濾兩次。取5mL上清液，加入5mL 0.02mol·L-12-硫代巴比妥酸溶液，沸水浴中保溫40min，取出冷卻1h后，以1600r/min離心5min，上清液中加5mL氯仿?lián)u勻，靜置分層后取上清液，分別在532nm和600nm處比色，記錄消光值并用以下公式計算TBA值。

1.2.6 揮發(fā)性鹽基氮值(TVB-N)的測定 取10g樣品斬碎均勻后，置于錐形瓶中，添加蒸餾水50mL，振搖后浸漬30min，過濾，取濾液按GB 5009.44-2003微量擴散法測定，標準鹽酸濃度為0.0lmol/L。

1.2.7 質構特性的測定 魚丸切成長1.5cm，寬1cm大小的長方體，用CT3質構儀進行分析。設定參數(shù):測量前探頭下降速度5.0mm/s，測試速度0.5mm/s，測量后探頭回程速度0.5mm/s，針入距離6mm。觸發(fā)力值5g，探頭類型p/5。

1.2.8 抗菌物質的HPLC分析 抗菌物質粗提物用甲醇溶解，經(jīng)0.45μm有機濾膜過濾后進行 HPLC分析。

HPLC分析條件如下:流動相:含0.1%三氟乙酸的乙腈(A)和純水(B)，洗脫過程:0～100%(A)，0～60min，100% ～0(B)，0～60min，流速為 1.0mL/min，檢測波長230nm。

1.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 采用SAS 8.2軟件對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析。當p＜0.05時，表示差異顯著，當p＞0.05時，表示差異不顯著。所有實驗重復3次。

2 結果與討論

2.1 不同濃度的抗菌物質對魚丸貯藏品質的影響

2.1.1 抗菌物質添加濃度對細菌總數(shù)的影響 含有不同添加量抗菌物質的魚丸在貯藏程中的細菌總數(shù)變化如圖1所示。魚糜制品衛(wèi)生標準(GB10132-2005)規(guī)定，非即食類魚糜制品細菌總數(shù)不得超過5×104cfu/g。從圖1可以看出，隨著貯藏時間的延長，細菌總數(shù)不斷增加，添加抗菌物質可以明顯抑制細菌的生長，且添加的濃度越高，抑制效果越好。未添加抗菌物質的魚丸在第16d其菌落數(shù)已達到5.66lg cfu/g，且表面發(fā)粘出現(xiàn)感官腐敗現(xiàn)象，而抗菌物質添加濃度分別為2mg/g和3mg/g的魚丸其菌落數(shù)為4.43lg cfu/g和4.32lg cfu/g，添加nisin的陽性組其菌落數(shù)為4.57lg cfu/g。表明所添加的抗菌物質與nisin均可有效延長魚丸的保藏時間。

方差分析表明，添加不同濃度抗菌物質的樣品組之間的抑菌活性具有顯著性差異(p＜0.005)。多重比較顯示，與對照組相比，添加濃度分別為2、3mg/g的樣品組(p＜0.001)及添加nisin的陽性組(p＜0.05)均存在顯著性差異，但這三組樣品之間的抑菌活性無顯著性差異，說明所制備的抗菌物質在魚丸儲藏過程中能夠有效地抑制微生物的生長，且以添加量2mg/g時效果最佳。

圖1 不同添加量的抗菌物質對魚丸貯藏過程中細菌總數(shù)的影響Fig.1 Effect of antimicrobial substance concentrations on the total bacterial count of fish-ball during storage

2.1.2 抗菌物質添加濃度對TBA值的影響 添加不同量抗菌物質的魚丸在貯藏過程TBA值的變化如圖2所示，隨著貯藏時間的延長，TBA值呈緩慢上升態(tài)勢。但添加抗菌物質以及nisin的樣品后，其TBA值在不同貯藏時間整體上小于空白對照組，添加濃度分別為2mg/g(p＜0.01)和3mg/g(p＜0.01)的樣品組與空白對照組相比有極顯著差異，表明枯草芽孢桿菌WL17抗菌物質具有一定的抗氧化活性，可有效抑制魚丸中脂質的氧化。

圖2 抗菌物質添加量對魚丸貯藏過程中TBA值的影響Fig.2 Effect of antimicrobial substance concentrations on the TBA of fish-ball during storage

2.1.3 抗菌物質添加濃度對TVB-N值的影響 TVB-N值反映水產(chǎn)品中的蛋白質在酶和細菌的作用下，發(fā)生分解而產(chǎn)生氨和胺等堿性含氮物的情況，是國標中用于評價肉質鮮度的唯一理化指標，其值越低，魚丸的新鮮度越高。由圖3可知，隨著貯藏時間的延長，TVB-N值不斷增大。到第16d，空白對照組的TVB-N值已達到3.23mg/100g，且出現(xiàn)發(fā)粘變質現(xiàn)象。而其它添加了不同濃度抗菌物質以及nisin的樣品組其TVB-N含量均低于3.0mg/100g。

多重比較表明，抗菌物質添加濃度分別為2mg/g(p＜0.05)和3mg/g(p＜0.05)的樣品組其TVB-N值與空白組相比有顯著性差異，但與nisin樣品組相比無顯著性變化，表明所制備的抗菌物質能夠有效控制TVB-N值，達到保鮮目的。

圖3 抗菌物質添加量對魚丸貯藏過程中TVB-N值的影響Fig.3 Effect of antimicrobial substance concentrations on the TVB-N of fish-ball during storage

2.1.4 抗菌物質添加濃度對硬度、彈性和咀嚼性的影響 魚丸制品的彈性是賦予制品獨特口感的重要特征，不僅在食味上，而且對制品的外觀、貯藏性也有較大的影響，硬度太低或太高都不利于魚丸的彈性。如圖4、圖5所示，添加抗菌物質的魚丸與空白組相比硬度(p＜0.01)和彈性(p＜0.01)都有顯著性差異。在貯藏過程中，隨著貯藏時間的延長，魚丸的硬度逐漸增加，彈性逐漸減弱。這可能是因為魚丸蛋白質發(fā)生變性失水，造成由肌動球蛋白溶膠凝固形成的網(wǎng)狀結構聚集，從而導致魚丸硬度上升彈性下降。而添加抗菌物質的魚丸在硬度和彈性方面均優(yōu)于空白對照組，這可能是因為抗菌物質主要為多肽類分子，能夠與蛋白質絡合使其網(wǎng)狀結構相對穩(wěn)定。

添加抗菌物質的魚丸貯藏過程中咀嚼性的變化如圖6所示，處理組與對照組相比咀嚼性沒有顯著差別(p＞0.05)，說明添加的抗菌物質對魚丸的咀嚼性沒有太大影響。

圖4 抗菌物質添加量對魚丸貯藏過程中硬度的影響Fig.4 Effect of antimicrobial substance concentrations on the hardness of fish-ball during storage

圖5 抗菌物質添加量對魚丸貯藏過程中彈性的影響Fig.5 Effect of antimicrobial substance concentrations on the springiness of fish-ball during storage

圖6 抗菌物質添加量對魚丸貯藏過程中咀嚼性的影響Fig.6 Effect of antimicrobial substance concentrations on the cohesiveness of fish-ball during storage

2.1.5 品質變化指標的相關性分析 對添加不同抗菌物質含量魚丸的菌落數(shù)、TBA、TVB-N、硬度、彈性和咀嚼性的變化與貯藏時間進行相關性分析，結果見表1。由表1可以看出，菌落數(shù)、TBA值和TVB-N值與貯藏時間存在良好的正相關性(r＞0.9)，彈性與魚丸成一定程度的負相關。

菌落數(shù)與各指標的相關性分析如表2所示，所有樣品的菌落數(shù)與TBA和TVB-N值均具有很好的正相關性，隨著貯藏時間的延長，菌落總數(shù)的增加，TBA和TVB-N值也迅速增加。這與相關報道相一致［2，8］。微生物的生長會促進魚丸的氧化酸敗，抗菌物質的添加可有效抑制微生物的生長，降低微生物降解蛋白質等營養(yǎng)成分的速率，延緩揮發(fā)性鹽基氮值的增大，另外抗菌物質主要為多肽類物質，可能本身也具有抗氧化活性，也在一定程度上抑制了魚丸的氧化酸敗，所以，對于添加了不同濃度抗菌物質的樣品，其菌落數(shù)均與TVB-N值和TBA值呈正相關。

表1 貯藏時間與菌落數(shù)、TBA、TVB-N、硬度、彈性和咀嚼性的相關性分析Table 1 Correlation analysis between storage time and bacterial count，TBA，TVB-N，hardness，springiness and cohesiveness

表2 菌落數(shù)與TBA、TVB-N、硬度、彈性和咀嚼性的相關性分析Table 2 Correlation analysis between bacterial count，TBA，TVB-N，hardness，springiness and cohesiveness

2.2 抗菌物質的HPLC分析

由抗菌物質的HPLC分析可知(見圖7)，其包含多種組分，色譜峰主要集中在30～40min、47～55min和57～60min三個區(qū)域，說明抗菌物質中可能存在三大類性質相似的抗菌物質。有研究報道枯草芽孢桿菌的某些菌株只能產(chǎn)生surfactin，而有些菌株卻能同時產(chǎn) 生 surfactin、fengycin 和 iturin或 surfactin、bacillomycin和plipastatin。而且，即使同一種菌株產(chǎn)生的同一種抗菌脂肽也不是純的單一化合物，而是由幾個或許多結構類似的同系物組成［9］，還有研究顯示枯草芽孢桿菌還能產(chǎn)生一些多烯類物質及其多肽類物質［10-11］，具有很好的抗細菌活性。本研究小組在前期研究中也發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌WL17產(chǎn)生的抗菌物質對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌都具有出色的抑制能力。因此，結合各種抗菌物質的抑菌特性及有關文獻［12-16］，可以推測枯草芽孢桿菌WL-17能夠產(chǎn)生多種不同分子量、不同結構類型的抗菌物質，對細菌和真菌都具有較好的抑制作用，但有關其主要抗菌物質的結構、性質、構效關系以及相關機制等還有待于進一步深入探討。

3 結論

化學防腐劑安全隱患的存在以及食品安全意識的提高，致使人們對不含化學防腐劑的天然、綠色食品的需求日益增大，開發(fā)高效安全的天然防腐劑對我國食品工業(yè)的發(fā)展具有重大意義。本次實驗結果表明，在魚丸中添加枯草芽孢桿菌WL17產(chǎn)生的抗菌物質能夠顯著地抑制微生物的生長，延長魚丸的保質期。當魚丸中抗菌物質的添加濃度為2mg/g時，其保鮮效果最佳，可使菌落數(shù)降低1.23個數(shù)量級，TBA值和TVB-N值與對照組相比上升緩慢，魚丸的質構特性也沒有顯著的變化，且與nisin的保鮮效果相當。因此，抗枯草芽孢桿菌WL17產(chǎn)生的抗菌物質作為一種天然防腐劑具有很好的開發(fā)價值。

圖7 抗菌物質粗提物HPLC色譜圖Fig.7 HPLC chromatograms of antimicrobial crude extract

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Effect of antimicrobial substance from Bacillus subtilis WL17 on preservation of fish-ball during storage

NAN Nan1，QI Xiang-yang2，*，YUAN Yong-jun2
(1.Food Science and Technology Department，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China;2.Faculty of Bioscience and Environmental Science，Zhejiang Wanli University，Ningbo 315100，China)

TS254.4

A

1002-0306(2012)12-0353-05

2011-08-30 *通訊聯(lián)系人

南楠(1984-)，男，碩士研究生，研究方向:天然產(chǎn)物化學功能成分的研究。

浙江省科技廳面上項目(2009C32017)。