枇杷蜜中脫落酸、多酚的測定及其指紋圖譜的研究

孫崇臻，吳希陽，黃才歡

暨南大學(xué)理工學(xué)院食品科學(xué)與工程系，廣州 510632

枇杷蜜是我國南方特有蜜種，不僅蜜質(zhì)細(xì)膩、營養(yǎng)豐富，而且具有潤肺、化痰、止咳的功效，受消費(fèi)者和制藥廠家的喜愛［1］。目前國內(nèi)對枇杷蜜的系統(tǒng)研究較少，僅在蜂蜜抗氧化性研究中有少數(shù)報(bào)道［2，3］。脫落酸作為一種植物激素，其含量變化與植物的種類及生長環(huán)境密切相關(guān)［4］。將脫落酸的檢測與蜂蜜蜜源識別相結(jié)合的研究國外已有報(bào)道［5-8］，國內(nèi)則較少［9］。酚類作為微量活性物質(zhì)在不同植物中分布差異較大，可以利用其差異來進(jìn)行植物來源的判別，目前國內(nèi)外對蜂蜜中酚類的研究相對比較成熟［10-15］。蜂蜜指紋圖譜就是應(yīng)用現(xiàn)代分析技術(shù)對蜂蜜中的糖類、蛋白質(zhì)及微量活性物質(zhì)等化學(xué)成分信息以圖形(圖像)的方式進(jìn)行表征并加以描述，利用它可以對蜂蜜的種類進(jìn)行識別［16-19］，同時(shí)為蜂蜜的摻假檢測提供依據(jù)。

本研究采用高效液相色譜-二極管陣列檢測技術(shù)同時(shí)對我國的10種枇杷蜜中的脫落酸及13種酚類進(jìn)行檢測，制定了枇杷蜜的HPLC指紋圖譜，并通過摻入油菜蜜的實(shí)驗(yàn)對標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行了驗(yàn)證。枇杷蜜酚類與脫落酸的分析及其指紋圖譜的建立對枇杷蜜的摻假檢測及功能性研究提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

從各大超市購買的來自廣東、廣西、浙江、福建、江西五省的10個(gè)知名品牌的枇杷蜜(標(biāo)記為P1-P10)，湖北、浙江的油菜蜜(標(biāo)記為G1、G2)，用于酚類及脫落酸的測定(表1)。

1.2 化學(xué)試劑

沒食子酸、原兒茶酸、槲皮素、蘆丁、3，4-二甲氧基肉桂酸、Amberlite XAD-2吸附樹脂(Sigma公司);咖啡酸、α-兒茶酸、p-香豆酸、阿魏酸、柚皮素、木犀草素、山奈酚、芹菜素(成都生物技術(shù)有限公司);脫落酸(上海佳和生物科技有限公司)。甲醇(色譜級，霍尼韋爾)、乙醚、甲酸(分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠);水為超純水、蒸餾水兩種。

1.3 主要儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀，配備SPD-M20A二極管陣列檢測器，CBM-20A系統(tǒng)控制器(日本島津公司);Welch XtimateTMC18(250 mm × 4.6 mm，5 μm，上海月旭科技有限公司);SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義市英峪予華儀器廠);ZFQ-85A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海醫(yī)械專機(jī)廠);B-260型恒溫水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠);無菌注射器(廣東康爾美醫(yī)療器械有限公司);0.45 μm微孔濾膜(天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.4 色譜條件

Welch XtimateTMC18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);檢測溫度為35℃;檢測波長為260 nm、285 nm、320 nm;流動相為甲醇與5%甲酸水溶液(5:95);洗脫梯度:時(shí)間為0-5-10-30-40-41-54-54.5-55-60 min，對應(yīng)甲醇含量為5-20-30-45-60-65-70-100-5-5%;流速為 0.8 mL/min;進(jìn)樣量為 10 μL。

1.5 樣品處理

對Yao［12］等報(bào)道的多酚提取條件進(jìn)行改進(jìn):準(zhǔn)確稱取100 g蜂蜜樣品與500 mL pH為2的鹽酸水溶液混合，磁力攪拌3 min，混勻后通過濾布除去溶液中的固體顆粒。將濾液與150 g Amberlite XAD-2樹脂(孔徑9 nm，粒度0.3 ～1.2 mm)混合，磁力攪拌10 min，使多酚物質(zhì)被充分吸附。將樹脂顆粒裝入玻璃柱(55×3.0 cm)中，依次用250 mL鹽酸溶液(pH=2)與300 mL蒸餾水沖洗柱子，除去糖類物質(zhì)及其他雜質(zhì)。用400 mL甲醇將酚類物質(zhì)洗出，并將洗脫液在45℃下真空旋轉(zhuǎn)蒸干，殘留物用5 mL水溶解，再用15 mL乙醚分三次萃取。乙醚提取物混合后在30℃條件下去除乙醚，干渣用1 mL甲醇復(fù)溶，0.45 μm濾膜過濾后置于4℃冰箱保存待測。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取各標(biāo)準(zhǔn)品10 mg置于10 mL棕色容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，配成濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，并置于4℃冰箱中避光保存，其它濃度標(biāo)準(zhǔn)品由儲備液稀釋得到。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 檢測波長的選擇

用二極管陣列檢測器對14種標(biāo)準(zhǔn)品在200～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，得出各組分的最大吸收波長，主要集中在 260、280、285、320、360 nm 五個(gè)波長。在這5個(gè)波長下對60 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)在260、285及320 nm波長下的分離效果最好，干擾最小，故選擇這三個(gè)波長作為檢測波長。

2.1.2 洗脫梯度的選擇

參考本課題組前期研究［9］的洗脫條件，在35℃檢測條件下，用甲醇與5%甲酸水溶液作流動相，以0.8 mL/min的流速對樣品進(jìn)行分析。當(dāng)進(jìn)樣量是20μL時(shí)，發(fā)現(xiàn)各物質(zhì)洗脫時(shí)間的間隔較大，并且最后兩種物質(zhì)未被完全洗出，分析原因是所用柱子不同對物質(zhì)的吸附能力不同所致，故對洗脫梯度進(jìn)行了調(diào)整，時(shí)間為 0-5-10-30-40-41-54-54.5-55-60 min時(shí)，對應(yīng)甲醇含量5-20-30-45-60-65-70-100-5-5%。在此洗脫梯度下，樣品中的14種物質(zhì)在50 min內(nèi)得到較好分離效果。

2.1.3 進(jìn)樣量的選擇

在2.1.2 的洗脫條件下，對濃度為60 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣20 μL，發(fā)現(xiàn)在260 nm波長下1號峰出現(xiàn)雙峰，分析主要原因有:一是標(biāo)準(zhǔn)品溶液的固有濃度過高;二是進(jìn)樣量偏大。于是在同樣的條件下對濃度為20 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣20 μL，發(fā)現(xiàn)雙峰并未消失，因此排除固有濃度高的原因。然后對濃度為60 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣10 μL，發(fā)現(xiàn)雙峰情況消失，可以說明雙峰的出現(xiàn)確實(shí)是因?yàn)檫M(jìn)樣量過高，確定最終進(jìn)樣10μL。

2.2 色譜條件的確定

由上述實(shí)驗(yàn)確定分離14種物質(zhì)的最終檢測條件為:檢測波長 260、285、320 nm，進(jìn)樣量 10 μL，流速0.8 mL/min，柱溫35℃，洗脫梯度為0-5-10-30-40-41-54-54.5-55-60 min時(shí)，對應(yīng)甲醇含量5-20-30-45-60-65-70-100-5-5%。在此條件下對濃度為60 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖1所示。

圖1 波長260 nm下標(biāo)準(zhǔn)品圖譜Fig.1 HPLC-DAD chromatogram of the 14 mixed standards at 260 nm

由圖1可知，14種物質(zhì)在50 min內(nèi)得到較好分離，出峰時(shí)間分布均勻，這與前期研究方法［9］相比，分析時(shí)間明顯縮短。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

取標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，配制質(zhì)量濃度為1.5、5、20、76、110、150、230、300 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。在已確定的色譜條件下，對不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣分析，平行測定三次，根據(jù)平均峰面積與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的含量關(guān)系進(jìn)行線性回歸，相關(guān)系數(shù)在0.9990到0.9999 之間，表明在 1.5 μg/mL 到300 μg/mL 的濃度范圍內(nèi)，各對照品質(zhì)量濃度與峰面積相關(guān)性良好。

2.4 精密度試驗(yàn)及加標(biāo)回收試驗(yàn)

取濃度為60 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品，日內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣6次，求得各色譜峰保留時(shí)間的RSD在0.05%～1.87%之間，峰面積的RSD 在2.02% ～3.37%之間，色譜峰的個(gè)數(shù)及特征沒有明顯變化，精密度較好。

取已知含量的樣品P1三份，各100 g，加入0.2 mL質(zhì)量濃度為110 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照樣品處理方法1.5進(jìn)行處理，在1.4的色譜條件下進(jìn)行測定。結(jié)果表明，除沒食子酸、原兒茶酸外，其余12種物質(zhì)加標(biāo)回收率均高于85%，表明在確定的實(shí)驗(yàn)條件下回收率良好。

2.5 樣品的測定

根據(jù)已確定的色譜條件對不同產(chǎn)地的枇杷蜜進(jìn)樣分析，測定各物質(zhì)的含量，結(jié)果見表1及圖2。同時(shí)對湖北、浙江兩省的油菜蜜進(jìn)樣分析，結(jié)果見表2及圖2。

由表1可知，14種檢測組分在枇杷蜜中的分布不同，其中α-兒茶酸、蘆丁、脫落酸含量最高，三者平均占總組分含量的68.9%，而3，4-二甲氧基肉桂酸、芹菜素含量則較低，這與本課題組的前期研究［9］結(jié)論一致;就總酚而言，不同產(chǎn)地枇杷蜜的總酚含量不同，其中廣東、浙江兩省相對較高，分別平均為420.2、476.7 μg/100 g 蜂蜜;廣西、江西兩省的總酚含量則較低;就酚酸與黃酮的分布而言，10個(gè)樣品的總酚酸含量均顯著高于總黃酮含量，這為枇杷蜜的功能性研究提供參考。

表1 不同產(chǎn)地枇杷蜜中脫落酸及13種多酚測定結(jié)果Table 1 Concentrations of abscisic acid and 13 phenolic compounds in loquat honey samples from different places

圖2 波長260 nm下的蜂蜜圖譜Fig.2 HPLC-DAD chromatograms of honey samples at 260 nm F2、F4、F8均為未知物;P2、P4、P8分別為廣西、浙江、廣東枇杷蜜;G1為湖北油菜蜜

由圖2可知，在260 nm下14種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均被檢出，但出峰情況有所不同，蘆丁、3，4-二甲氧基肉桂酸及脫落酸峰高相對較大，出峰時(shí)間比較集中(30.485 ～36.143 min)，而柚皮素、木犀草素及芹菜素峰高則較小，出峰時(shí)間相對分散(41.813～48.533 min);不同品種的蜂蜜各物質(zhì)分布不同，油菜蜜中各物質(zhì)峰高較大，分布比較均勻，而枇杷蜜中各物質(zhì)的峰高分布差異較大。此外，不同產(chǎn)地枇杷蜜的圖譜存在差異，但均含有未知組分F，油菜蜜中則沒有，通過波長掃描及峰形分析，可知此組分并非是純物質(zhì)，而是混合物。

2.6 摻入油菜蜜試驗(yàn)

將油菜蜜G1與已知含量的枇杷蜜P6以五種不同比例混合(表2:H1-H5)，按照確定的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行處理測定。結(jié)果如表2所示。

表2 油菜蜜及混合蜜樣品中脫落酸及13種多酚測定結(jié)果Table 2 Concentrations of abscisic acid and 13 phenolic compounds in rapeseed honey and mixed honey samples

由表2可知，兩種油菜蜜的總酚含量均大于700 μg/100 g蜂蜜，其中總酚酸含量平均為472.5 μg/100 g蜂蜜，顯著高于總黃酮含量(平均為371.2 μg/100 g蜂蜜);對比表1及表2可知，不同蜜種各物質(zhì)的含量有明顯差異，這與前期研究［9］結(jié)論一致。其中油菜蜜中的α-兒茶酸、蘆丁及脫落酸顯著高于三者在枇杷蜜中的含量分布;不同種類蜂蜜中總酚含量不同，油菜蜜的總酚含量(平均為843.3 μg/100 g蜂蜜)顯著高于枇杷蜜的總酚含量(平均為391.2 μg/100 g 蜂蜜)。

此外，摻入不同比例油菜蜜的混合蜜中各物質(zhì)的含量不同，除沒食子酸、槲皮素外，其余12種物質(zhì)含量從H1到H5呈現(xiàn)減少趨勢，這與其在油菜蜜G1及枇杷蜜P6中的含量分布有關(guān);分析總酚的含量可知，不同混合蜜中總酚含量不同，摻入油菜蜜的量越少其總酚含量越接近枇杷蜜P6的固有含量(263.4 μg/100 g)，當(dāng)摻入量為 95%(H4)時(shí)其總酚含量與P6的總酚含量基本一致;對比表1及表2可知，摻入量為50%(H1)時(shí)，總酚含量(598.3 μg/100 g)接近 G1、P6 總酚含量的平均值(604.6 μg/100 g)，摻入10%的油菜蜜總酚含量已有明顯差異，因此利用總酚含量可以進(jìn)行10%以上的摻假鑒別。

2.7 枇杷蜜指紋圖譜的制定

根據(jù)中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)(2004A版)對10批枇杷蜜的圖譜進(jìn)行處理，設(shè)定時(shí)間寬度為0.3 min，通過多點(diǎn)校正及自動匹配構(gòu)造枇杷蜜的指紋圖譜，生成含有15個(gè)共有峰的對照圖譜(圖3)，計(jì)算這15個(gè)共有峰在10種枇杷蜜中的相對保留時(shí)間。結(jié)果顯示，相對保留時(shí)間的RSD均小于 0.74%。

圖3 10種枇杷蜜HPLC圖譜與對照指紋圖譜(260 nm)Fig.3 HPLC matched chromatograms of 10 batches loquat honey samples and the reference fingerprint at 260 nm

西南大學(xué)的王文靜［17］利用高效液相色譜技術(shù)對洋槐蜜中的黃酮類化合物進(jìn)行研究，找出7個(gè)共有峰，建立了洋槐蜜指紋圖譜;吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)的董蕊［18］利用高效液相色譜技術(shù)對椴樹蜜、苕子蜜及刺槐蜜中的17種氨基酸進(jìn)行了分析，并建立了相關(guān)指紋圖譜。本研究則利用高效液相色譜技術(shù)建立了南方特有蜜種-枇杷蜜的脫落酸及酚類指紋圖譜，找出15個(gè)共有峰。

將15個(gè)共有峰與14種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行保留時(shí)間與紫外吸收光譜的對比，可以對11個(gè)共有峰進(jìn)行判定，峰2～6分別為原兒茶酸、α-兒茶酸、咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸;峰8～10分別為蘆丁、3，4-二甲氧基肉桂酸、槲皮素;峰13～15則分別對應(yīng)柚皮素、木犀草素、山奈酚。枇杷蜜指紋圖譜的制定擴(kuò)大了蜜種檢測范圍，為單花蜜的判別提供依據(jù)。

2.8 相似度評價(jià)及枇杷蜜指紋圖譜的驗(yàn)證

采用中位數(shù)法對10個(gè)品牌的枇杷蜜進(jìn)行相似度評價(jià)，并將油菜蜜G1、G2及混合蜜H1至H5與枇杷蜜的對照圖譜進(jìn)行相似度分析，從而對指紋圖譜進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如表3及表4所示。

表3 枇杷蜜所有峰與對照圖譜的相似度Table 3 Similarity of loquat honey samples and reference fingerprint

由表3可知，10種枇杷蜜與對照圖譜的相似度在0.920-0.997之間，相似度良好，符合構(gòu)造指紋圖譜的要求(0.9 ～1.0)。

表4 油菜蜜、混合蜜所有峰與對照圖譜的相似度Table 4 Similarity of rape honeys，mixed honeys and reference fingerprint

從油菜蜜G1、G2與對照圖譜的相似度可知，油菜蜜與枇杷蜜的相似度極低(小于0.4)，指紋圖譜的制定可有效區(qū)分這兩種蜂蜜;混合蜜H1、H2與對照圖譜的相似度均小于0.9，說明本實(shí)驗(yàn)的指紋圖譜可用于鑒別30%以上的油菜蜜摻假。與利用總酚含量判別摻假程度(10%以上)相比，利用指紋圖譜的相似度評價(jià)雖然只能判別30%以上的蜂蜜摻假，但是相對更簡便，更快速。

西北大學(xué)的周夢遙［19］利用HPLC-ECD技術(shù)制定了向日葵蜜的多酚類指紋圖譜，相似度在0.778至0.978之間，并利用相似度的分析成功鑒別出50%以上的果葡糖漿摻假。本研究制定的枇杷蜜的指紋圖譜，相似度均在0.92以上，并能成功鑒別出30%以上的油菜蜜摻假。

3 結(jié)論

目前蜂蜜摻假手段日益多樣化，使我國的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)面臨挑戰(zhàn)，質(zhì)量監(jiān)管遇到困難，尤其是近幾年出現(xiàn)的高價(jià)單花蜜中添加廉價(jià)蜜的摻假現(xiàn)象，使我們的檢測更加舉步維艱，因此建立快速高效的檢測標(biāo)準(zhǔn)變得十分迫切。本研究對不同省份不同品牌的枇杷蜜進(jìn)行脫落酸及13種多酚的測定，成功的對其進(jìn)行定性定量分析，制定出枇杷蜜的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，并通過摻入不同含量油菜蜜的實(shí)驗(yàn)對指紋圖譜進(jìn)行了驗(yàn)證，這對枇杷蜜的質(zhì)量控制及功能性分析有重要意義。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的混合物F在枇杷蜜中占相當(dāng)比例，對其需要做進(jìn)一步的分析研究。此外，高價(jià)單花蜜中摻入的廉價(jià)蜜除了油菜蜜以外，還有其它蜜種可以摻入，因此，需要對更多的蜜種進(jìn)行研究。

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