稻曲球脂溶性成分及其抗細菌和抗氧化活性

劉志強，王 平，單體江，孫偉波，劉 浩，孫文獻，周立剛*

1湖南科技大學生命科學學院;2湖南科技大學化學化工學院，湘潭 411201;3中國農業(yè)大學農學與生物技術學院，北京 100193

稻曲病(Rice false smut)是危害水稻的一種重要的真菌病害［1］。稻曲病病原為稻綠核菌，無性態(tài)學名為Ustilaginoidea virens(Cooke)Takahashi。有性態(tài)學名為Villosiclava virens(Nakata)Tanaka et Tanaka［2］。迄今，稻曲病菌中已闡明的次生代謝產物有兩類，第一類為黑粉菌素(Ustilaginoidins)，屬于萘并吡喃酮類;另一類為稻曲菌素(Ustiloxins)，屬于環(huán)肽類［3，4］。研究表明，稻曲菌素能夠抑制真核生物微管蛋白的組裝與細胞骨架的形成，抑制細胞有絲分裂，具有明顯的抗腫瘤活性，作為抗腫瘤藥物的開發(fā)具有較好的應用前景［5-7］。我國對稻綠核菌中次生代謝產物的研究還十分初步，僅見對其粗提物的報道［8，9］。稻綠核菌在水稻穗部為害，形成主要由厚垣孢子和菌絲組成的稻曲球。尚未見稻曲球脂溶性成分的研究報道，本研究制備了稻曲球石油醚提取物，采用水蒸氣蒸餾法制備了石油醚提取物的油狀物，同時從石油醚提取物中分離到3個單體化合物，對其進行了抗細菌和抗氧活性的測定，為稻曲球脂溶性成分的開發(fā)和利用提供依據，同時也為系統(tǒng)了解稻曲球中次生代謝產物的種類提供基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

稻曲球于2010年9月底采自遼寧省東港市，室溫晾干，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與試劑

水蒸氣蒸餾裝置(北京永光明醫(yī)療器械廠);GC-MS聯(lián)用儀(Agilent 6890 GC-5973 MSD，美國安捷倫公司);Bruker Avance DPX-300型和DRX-400型核磁共振波譜儀(瑞士Bruker公司);Apex IV型飛行時間質譜儀(瑞士Bruker公司);VSP-3050型中低壓液相色譜儀(東京理化器械株式會社);XT4-100B型顯微熔點測定儀(北京科儀電光儀器廠);PowerWave HT多孔板分光光度計(美國BioTek公司)。

甲醇、石油醚、丙酮、氯仿、二氯甲烷等均為市售分析純;薄層層析硅膠(GF254)和柱層析硅膠(60～80目和200～300目)均購自青島海洋化工有限公司;CDCl3(北京騰達遠科技有限公司);Sephadex LH-20(Pharmacia公司);噻唑藍(MTT，美國Amresco公司);硫酸鏈霉素(Serva公司);其他試劑均為分析純。

1.3 化合物分離與純化

稻曲球6.0 kg，粉碎后用甲醇室溫(25℃)浸泡3次，每次7 d，合并濾液并濃縮至干(1964 g)，然后加入適量蒸餾水制成懸浮液，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進行液-液萃取，重復5次，合并萃取液并濃縮成浸膏。分別得石油醚萃取物310 g，乙酸乙酯萃取物136 g，正丁醇萃取物318 g，水層濃縮成浸膏1200 g。將石油醚萃取部分經水蒸氣蒸餾，得油狀物 21.7 g。

將石油醚萃取物浸膏經硅膠柱層析，石油醚-丙酮(3∶1，v/v)洗脫，合并部分經二氯甲烷-甲醇梯度(1∶0→0∶1，v/v)洗脫，經 Sephadex LH-20 凝膠柱層析和重結晶，得化合物1(30 mg)、化合物2(25 mg)和化合物3(8.5 mg)。

1.4 油狀物的GC-MS分析

GC條件:6890N Network氣相色譜儀(Agilent);色譜柱為HP-5石英毛細管柱(30 m ×0.25 m ×0.25 μm，Agilent)。進樣口溫度 250 ℃，傳輸線溫度240℃。程序升溫如下:起始柱溫50℃停留1.5 min;以10℃/min升至180℃，停留2 min;然后以6℃/min升至280℃，停留10 min。載氣為高純氦(99.999%);柱流量 1 mL/min。進樣量 1.0 μL(分流比為 1∶20)。

MS條件:離子源溫度280℃;電離方式EI，電離能量70 eV;質量掃描范圍m/z 50～500 amu。

采用GC峰面積歸一化法確定各組分峰相對含量(Relative content)。依據C8-C40各正烷烴的保留時間，按Van den Dool和Kratz法來確定保留系數(shù)(Retention index，RI)［10］。各組分峰用 NIST Library(2002版)質譜庫進行檢索，最后以質譜匹配度和RI值匹配度最高的化學結構為最佳鑒定結果，無RI值匹配的采用質譜匹配度最高的化學結構。

1.5 抗細菌活性測定

所用的供試微生物枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis;縮寫為B.s.)為革蘭氏陽性細菌;黃瓜角斑病菌(Pseudomonas lachrymans，縮寫為 P.l.)、根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens，縮寫為 A.t.)、番茄瘡痂病菌(Xanthomonas vesicatoria，縮寫為 X.v.)為革蘭氏陰性細菌。采用多孔板-MTT分光光度法測定樣品對細菌的最低抑制濃度(MIC)值［11］和半抑制濃度(IC50)值［12］，以硫酸鏈霉素為陽性對照。數(shù)據處理參考相關文獻［13］，根據抑制率(%)，查幾率值表，可得抑制率幾率值(Y)，將化合物濃度(μg/mL)換算成濃度對數(shù)(X)，即可求出線性方程(Y=aX+b)，根據線性方程可求出樣品的半抑制濃度(IC50)。

1.6 抗氧化活性測定

采用樣品對Fe2+螯合能力來評價其抗氧化活性［18］，具體測定步驟如下:先向96孔板中加入30 μL濃度為0.2 mg/L的FeCl2·4H2O溶液，然后加入50 μL不同濃度的樣品溶液，混合后再加入70 μL濃度為2.0 mg/L的菲啰嗪溶液，振蕩混勻，室溫下反應10 min，然后用多孔板分光光計測定其在560 nm處的吸收值，每個處理4個重復，以乙二胺四乙酸(EDTA)為陽性對照。數(shù)據處理參考文獻［13，14］，設供試樣品濃度(μg/mL)為 Y，F(xiàn)e2+螯合率(%)為X，求得Fe2+螯合率回歸方程(Y=aX+b)，從而可以求出樣品對Fe2+螯合能力的有效中濃度(EC50)。

2 結果與分析

2.1 稻曲球石油醚提取物油狀物的化學組成

通過水蒸氣蒸餾，從稻曲球石油醚提取物中獲得21.7 g油狀物，占石油醚提取物重量的7.0%，占稻曲球重量的0.36%(以干重為基礎)。通過GCMS分析，各組分峰用NIST Library(2002版)質譜庫進行檢索，共鑒定出14個成分，占總量的99.9%。采用GC峰面積歸一化法定量分析，計算出各成分的相對含量(見表1)，主要成分為14-甲基十五烷酸甲酯(30.09%)、棕櫚酸(10.52%)、10，13-十八碳二烯酸甲酯(37.31%)、十八烷酸甲酯(5.54%)和(Z，Z)-9，12-十八碳二烯酸(15.63%)，表明稻曲球產生的油狀物成分中主要為脂肪烴和脂肪酸酯類物質。

表1 石油醚提取物油狀物的化學成分Table 1 Chemical composition of the oily fraction from petroleum ether extract

2.2 化合物的結構鑒定

化合物1:白色膏狀物(CHCl3);mp.81～86℃;ESI-MS m/z:281 ［M-H］-;1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ:5.34(2H，m，H-9，H-10)，2.34(2H，t，J=15.0，7.5 Hz，H-2)，2.01(m)，1.62(2H，m)，1.30(m)，0.88(3H，t，J=13.4，6.3 Hz，H-18);13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ:180.30(C-1)，130.16(C-9)，129.87(C-10)，14.26(C-18)。以上數(shù)據與文獻報道一致［15］，該化合物鑒定為油酸(Octadecenoic acid)。

化合物2:白色片狀晶體(CHCl3);mp.78～82℃;ESI-MS m/z:561［M-H］-;1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ:0.88(6H，t，J=13.4，6.4 Hz，CH3× 2)，1.25(76H，br，CH2×38)。以上數(shù)據與文獻報道一致［16，17］，該化合物鑒定為正四十烷(Tetracontane)。

化合物3:無色針狀晶體(CHCl3);mp.162～168℃;ESI-MS m/z 397［M+H］+;1H NMR(CDCl3，300 MHz)δ:5.57(1H，m，H-6)，5.38(1H，m，H-7)，5.17(2H，m，H-22，H-23)，3.63(1H，m，H-3)，1.04(3H，d，J=4.4 Hz，H-21)，0.95(3H，s，H-19)，0.92(3H，d，J=5.3 Hz，H-28)，0.84(3H，d，J=4.6 Hz，H-27)，0.82(3H，d，J=4.6 Hz，H-26)，0.63(3H，s，H-18);13C NMR(CDCl3，75 MHz)δ:38.4(C-1)，32.0(C-2)，70.5(C-3)，40.8(C-4)，139.8(C-5)，119.6(C-6)，116.3(C-7)，141.3(C-8)，46.3(C-9)，37.1(C-10)，21.1(C-11)，39.5(C-12)，43.3(C-13)，54.5(C-14)，28.2(C-15)，23.0(C-16)，56.0(C-17)，12.0(C-18)，16.3(C-19)，40.4(C-20)，21.6(C-21)，132.0(C-22)，135.6(C-23)，42.8(C-24)，33.1(C-25)，19.6(C-26)，19.9(C-27)，17.6(C-28)。以上數(shù)據與文獻報道一致［18］，該化合物鑒定為為麥角甾-5，7，22-三烯-3-醇 (Ergosta-5，7，22-trien-3-ol)。

2.3 抗細菌活性

麥角甾-5，7，22-三烯-3-醇(3)對 4 種供試細菌表現(xiàn)出較強的抑制活性(表2)，其中對黃瓜角斑病菌的抑制活性最強，MIC值和IC50值分別為30.0 μg/mL和25.70 μg/mL。石油醚提取物油狀物僅對枯草芽孢桿菌表現(xiàn)出弱的抑制活性，MIC值和IC50值分別為 150.0 μg/mL 和 148.29 μg/mL。油酸(1)和正四十烷(2)未檢測出抗細菌活性。

表2 麥角甾-5，7，22-三烯-3-醇和油狀物的抗細菌活性Table 2 Antibacterial activity of ergosta-5，7，22-trien-3β-ol and the oily fraction

2.4 抗氧化活性

采用螯合鐵離子的能力來評價樣品的抗氧化活性，油酸(1)和正四十烷(2)以及油狀物均表現(xiàn)出一定的螯合亞鐵離子能力(表3)，其EC50值分別為74.82 μg/mL、23.58 μg/mL 和 37.88 μg/mL，以正四十烷的螯合能力最強。麥角甾-5，7，22-三烯-3-醇(3)未檢測出螯合亞鐵離子的活性。

表3 化合物對Fe2+的螯合能力Table 3 Fe2+chelating activity of components

3 討論

稻曲球主要由稻曲病菌的厚垣孢子和菌絲組成，本研究結果表明稻曲球能產生多種脂肪烴和脂肪酸酯類化合物，這些化合物在稻曲病菌致病過程中的生理生態(tài)功能值得深入研究。稻曲球中的脂溶性成分具有一定的抗菌和抗氧化活性，提示稻曲球除用于制備稻曲菌素(一類具有應用潛力的抗腫瘤活性成分［5-7］)外，還可用于制備脂溶性活性成分，這為稻曲球活性成分的開發(fā)與利用提供了依據。本論文是首次對稻曲球中脂溶性成分及其生物活性的報道。稻曲球其他成分的分離純化與結構鑒定及生物活性評價正在進行之中。

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