真菌竹黃雙向調(diào)節(jié)TNF-α誘導(dǎo)的L929細(xì)胞凋亡過(guò)程

張樹(shù)冰，周亞玲，李 凌，李 杰

中南大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410013

真菌竹黃(Shiraia bambusicola)是一種傳統(tǒng)的民間中藥，具有補(bǔ)中益氣、祛風(fēng)利濕、抗菌消炎等功效，是一種非常值得開(kāi)發(fā)利用的藥用真菌資源［1］。臨床上竹黃主治風(fēng)濕性及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、跌打損傷、腰肌勞損、筋骨酸痛等［2］，其所含組分或成分，顯示了較強(qiáng)的藥理作用，具有保肝護(hù)肝、抗氧化、促凋亡、抗病毒、抗菌和抗腫瘤等功能［3-6］，其作用的有效部位、活性成分及作用機(jī)理等方面的研究尚處于起步階段。

腫瘤與炎癥具有非常緊密的關(guān)系，腫瘤與炎癥之間是一條雙向道:一方面炎癥對(duì)腫瘤發(fā)生具有促進(jìn)作用;另一方面，腫瘤也可引發(fā)炎癥，彼此的信號(hào)通路之間存在著強(qiáng)烈對(duì)話，形成復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)［7，8］。腫瘤壞死因子 α(TNF-α)是一種主要由單核-吞噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，可激活細(xì)胞凋亡和炎癥應(yīng)答等信號(hào)通路，這些信號(hào)通路之間相互關(guān)聯(lián)相互制約，對(duì)細(xì)胞的最終效應(yīng)取決于占主導(dǎo)地位的通路［9，10］。TNF-α 相關(guān)信號(hào)通路在腫瘤和炎癥之間的相互誘發(fā)、腫瘤及炎癥相關(guān)疾病治療過(guò)程中都起到非常重要的作用，是連接炎癥和腫瘤的一個(gè)調(diào)控關(guān)聯(lián)子［11］，介導(dǎo)腫瘤和炎癥信號(hào)通路之間的對(duì)話過(guò)程。

竹黃既具有抗炎特性又可以發(fā)揮抗腫瘤功能，而TNF-α信號(hào)通路與炎癥和腫瘤密切相關(guān)，我們推測(cè)竹黃的活性組分可能對(duì)TNF-α信號(hào)通路系統(tǒng)起到干預(yù)作用。最新研究也表明，成纖維細(xì)胞不僅在傷口愈合、組織缺陷和骨創(chuàng)傷修復(fù)等過(guò)程中發(fā)揮著積極作用，其也能對(duì)身體產(chǎn)生危害，與腫瘤生長(zhǎng)與炎癥發(fā)生密切相關(guān)［12］。因此，我們以TNF-α誘導(dǎo)小鼠成纖維細(xì)胞(L929細(xì)胞)為模型，探討竹黃對(duì)該模型的作用方式，所涉及的TNF-α通路是腫瘤和炎癥相關(guān)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的重要組成部分。研究發(fā)現(xiàn)，真菌竹黃可以雙向調(diào)節(jié)TNF-α誘導(dǎo)的L929細(xì)胞凋亡過(guò)程，高濃度竹黃提取物協(xié)同TNF-α誘導(dǎo)L929細(xì)胞凋亡;低濃度竹黃提取物可能通過(guò)抑制COX-2表達(dá)和促進(jìn)BCL-2表達(dá)等作用抵抗TNF-α誘導(dǎo)L929細(xì)胞凋亡過(guò)程。

1 材料及方法

1.1 索式提取法獲得竹黃總提取物

竹黃子座于60℃恒溫干燥箱中干燥至恒重，然后粉碎成粉末。稱取10 g竹黃粉末用濾紙包好，置于索式提取器中，加入75%的乙醇，樣料比為1∶6，電熱套加熱至提取器中回流的液體液體顏色很淺。收集紅色液體于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮提取液，將濃縮的提取液置于皿中，放在恒溫干燥箱中60℃干燥至恒重膏狀，稱取藥膏質(zhì)量。恒重竹黃藥膏加入DMSO溶解，配成50 mg/mL的藥物原液，4℃保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)按所需的工作濃度進(jìn)行稀釋。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

L929細(xì)胞以RPMI1640培養(yǎng)基中(含10%新生小牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL)培養(yǎng)，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)，3～4 d傳代1次。用0.25%胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L929細(xì)胞，消化90 s，去掉胰酶加入新鮮培養(yǎng)基，用彎頭吸管將細(xì)胞消化下來(lái)，收集于離心管中，取適量細(xì)胞懸液于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，進(jìn)行計(jì)數(shù)，以每孔1×104細(xì)胞接種96孔板。待鏡下觀察細(xì)胞貼壁后，棄掉培養(yǎng)液，加入含有藥物的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞3 d。

1.3 細(xì)胞形態(tài)觀察和Hochest33258熒光染色

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L929細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，計(jì)數(shù)，以5×104細(xì)胞/孔接種6孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至50% ～80%滿時(shí)，加入各設(shè)計(jì)濃度組處理細(xì)胞48 h。處理完畢，吸盡培養(yǎng)液，加入0.5 mL含4%多聚甲醛或70%乙醇的固定液，固定30 min。去固定液，用 PBS或0.9%NaCl洗兩遍，每次 3 min，加入 0.5 mL Hoechst 33258染色液，避光染色5 min。去染色液后，用PBS或0.9%NaCl洗兩遍，每次3 min。最后每孔加入0.5 mL PBS在倒置顯微鏡下觀察;熒光顯微鏡下用紫外光激發(fā)，可檢測(cè)到呈藍(lán)色的細(xì)胞核，凋亡細(xì)胞的核比正常細(xì)胞小，且亮度高。

1.4 磺酰羅丹明B(SRB)法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用柱狀圖

首先，棄掉培養(yǎng)基，每孔加入預(yù)冷的 100 μL10%三氯醋酸(TCA)溶液，4℃固定1小時(shí)，棄掉TCA固定液，1%醋酸溶液洗滌3遍，自然干燥后，每孔加入100 μL 0.4%SRB 染液，室溫染色 30 min，用1%醋酸溶液洗3遍，洗掉未與蛋白結(jié)合的染液，自然干燥后，加入150 uL 10 mM Tris堿液(pH10.5)溶解。置搖床上低速振蕩10 min后，在酶標(biāo)儀上用OD490 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的吸光值。

根據(jù)吸光值計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率:細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(1-試驗(yàn)組 A490/對(duì)照組 A490)×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，應(yīng)用SPCC統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以藥物濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用柱狀圖。

1.5 Western Blot實(shí)驗(yàn)

等量的細(xì)胞總蛋白提取物，進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，然后進(jìn)行麗春紅染色、脫色，確定轉(zhuǎn)膜成功后，脫脂奶粉封閉過(guò)夜。TBS洗滌三次后，加一抗，于37℃ 溫育2 h，TBS洗滌三次后，再加二抗，于37℃ 溫育2 h，TBS洗滌三次后進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光、顯影、定影。實(shí)驗(yàn)以β-actin蛋白為內(nèi)參。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 竹黃對(duì)L929細(xì)胞的影響

Hoechst染色后，在熒光顯微鏡下觀察:陰性對(duì)照組細(xì)胞大小均勻，邊緣清晰，細(xì)胞排列緊密，在紫外激發(fā)下可見(jiàn)細(xì)胞核呈均質(zhì)的藍(lán)色(圖1A，a);TNF-α(4 ng/mL)組細(xì)胞大量死亡，細(xì)胞密度急劇減小，細(xì)胞縮小，熒光顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞核呈碎塊狀致密濃染(圖1B，b)，為典型的凋亡形態(tài);120 μg/mL竹黃組細(xì)胞變圓縮小，紫外激發(fā)可見(jiàn)與TNF-α(4 ng/mL)組相似的核凝縮現(xiàn)象(圖1C，c);60 μg/mL竹黃組有很多細(xì)胞濃縮變圓，但在紫外激發(fā)下，觀察到細(xì)胞核略微變小，核染色均勻(圖1D，d);30 μg/mL竹黃組(圖1E，e)已經(jīng)很難從形態(tài)學(xué)水平觀察到與陰性對(duì)照組的區(qū)別。Hoechst實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過(guò)不同濃度竹黃與L929細(xì)胞作用發(fā)現(xiàn)，高濃度竹黃可以誘導(dǎo)L929細(xì)胞凋亡，而當(dāng)濃度為30 ng/mL時(shí)，對(duì)細(xì)胞基本無(wú)影響。這一結(jié)果有利于我們選擇合適的竹黃濃度(≤30 ng/mL)進(jìn)行與 TNF-α(4 ng/mL)共同誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，以探求竹黃參與TNF-α信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的具體作用機(jī)理。

圖1 不同濃度的竹黃作用48 h后L929細(xì)胞的形態(tài)變化(×400)Fig.1 Morphologic changes of L929 cells after treatment with different concentrations of Shiraia extracts for 48 h(×400).

2.2 竹黃雙向調(diào)節(jié)TNF-α誘導(dǎo)的L929細(xì)胞凋亡過(guò)程

應(yīng)用SRB實(shí)驗(yàn)法，我們測(cè)量不同濃度竹黃提取物對(duì)TNF-α(4 ng/mL)誘導(dǎo)L929細(xì)胞凋亡這一模型的影響作用。在酶標(biāo)儀上用OD490 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的吸光值，然后根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(1-試驗(yàn)組A490/對(duì)照組A490)×100%，見(jiàn)表 1。

表1 不同濃度的竹黃提取物對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的L929細(xì)胞的影響，n=3)Table 1 Effect of Shiraia extracts on L929 induced by TNF-α，n=3)

表1 不同濃度的竹黃提取物對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的L929細(xì)胞的影響，n=3)Table 1 Effect of Shiraia extracts on L929 induced by TNF-α，n=3)

*:P ＜0.05(SPSS軟件分析).

竹黃提取物濃度(μg/ml)Concentration抑制率(%)60.77% ±0.38%15+4 ng/mLTNFα 0.281 ±0.002 49.07% ±0.38%7.5+4 ng/mLTNFα 0.311 ±0.004* 43.64% ±0.77%*3.75+4 ng/mLTNFα 0.313 ±0.005* 43.37% ±0.86%*1.88+4 ng/mLTNFα 0.329 ±0.003* 40.44% ±0.52%*0.94+4 ng/mLTNFα 0.309 ±0.002* 44.14% ±0.32%*0.47+4 ng/mLTNFα 0.291 ±0.022 47.35% ±3.97%0+4 ng/mLTNFα 0.287 ±0.006 47.99% ±1.02%0+0 ng/mLTNFα(對(duì)照組)Inhibition 30+4 ng/mLTNFα 0.217 ±0.002*吸光度A490值A(chǔ)bsorbance 0.558 ±0.005 0

以藥物濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用柱狀圖(圖2)。研究發(fā)現(xiàn)，竹黃提取物在濃度0.94 ～7.5 μg/mL 范圍內(nèi)能減小TNF-α對(duì)L929細(xì)胞的抑制作用，且當(dāng)竹黃濃度在1.88 μg/mL時(shí)，抑制效果最為明顯，此時(shí)的抑制率與TNF-α(4 ng/mL)組相比下降15.8%;當(dāng)濃度大于1.88 μg/mL時(shí)這種作用隨竹黃濃度的增高而逐漸減小，當(dāng)濃度小于1.88 μg/mL時(shí)隨竹黃濃度的減小而減小。當(dāng)竹黃提取物濃度為15 μg/mL或者0.47 μg/mL時(shí)與陽(yáng)性對(duì)照組相比沒(méi)有明顯差異;而當(dāng)竹黃濃度繼續(xù)增大到達(dá)30 μg/mL時(shí)抑制率與TNF-α(4 ng/mL)組相比上升26.6%。

圖2 不同濃度的竹黃提取物對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的L929細(xì)胞的影響Fig.2 Effect of Shiraia extracts on L929 induced by TNF-α

2.3 竹黃對(duì)COX-2蛋白表達(dá)的影響

用Western blotting分析不同濃度的竹黃提取物通常情況下在大多數(shù)組織細(xì)胞中不表達(dá)或表達(dá)極低，受炎癥或致癌物等刺激時(shí)表達(dá)迅速上調(diào)［18］。COX-2與炎癥發(fā)生以及多種癌癥的發(fā)生都密切相關(guān)，COX-2特異性抑制劑能減輕RA病人的癥狀并緩解RA引起的慢性疼痛［19］。在本研究中，TNF-α誘導(dǎo)L929細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的COX-2表達(dá)量與陰性對(duì)照組比較顯著提高;30 μg/mL與15 μg/mL竹黃實(shí)驗(yàn)組COX-2的表達(dá)量與TNF-α誘導(dǎo)組相比沒(méi)有顯著的差別，但 7.5 μg/mL 與 3.75 μg/mL 竹黃實(shí)驗(yàn)組的COX-2的表達(dá)量逐漸減弱，推測(cè)竹黃可能通過(guò)降低 COX-2的表達(dá)量進(jìn)而抑制 TNF-α誘導(dǎo)的L929細(xì)胞凋亡。

BCL-2(B-cell lymphoma-2)基因首先是在B細(xì)胞濾泡性淋巴瘤中被發(fā)現(xiàn)的，過(guò)表達(dá)BCL-2抑制細(xì)胞凋亡［20］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低濃度竹黃實(shí)驗(yàn)組與TNF-α(4 ng/mL)組相比，BCL-2的表達(dá)量顯著增強(qiáng)。這一結(jié)果與細(xì)胞水平觀察到的竹黃濃度在7.5～1.88 μg/mL 范圍內(nèi)降低TNF-α 對(duì)L929 細(xì)胞抑制率的現(xiàn)象是相一致的，表明在一定濃度范圍內(nèi)竹黃通過(guò)誘導(dǎo)上調(diào)BCL-2的表達(dá)來(lái)提高細(xì)胞的存活率，從而抵抗TNF-α對(duì)L929細(xì)胞的凋亡作用。

NF-κB是一種常見(jiàn)的轉(zhuǎn)錄因子，它的活化形式是異二聚體，通常包括P65和P50兩個(gè)蛋白質(zhì)亞單位，在許多慢性炎癥疾病中的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中NF-κB都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，最終決定細(xì)胞命運(yùn)的是 TNF-信號(hào)通路間的平衡［21，22］。在本實(shí)驗(yàn)中，與陰性對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組NF-κB P65蛋白表達(dá)量均上升，說(shuō)明NF-κB P65蛋白是TNF-α誘導(dǎo)L929細(xì)胞凋亡過(guò)程中的重要調(diào)控因子，但由于其表達(dá)量并沒(méi)有隨著抑制凋亡現(xiàn)象發(fā)生而改變，推測(cè)其可能不是竹黃干預(yù)TNF-α信號(hào)網(wǎng)絡(luò)過(guò)程中的關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白，在竹黃抑制L929細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用不明顯，相關(guān)分子機(jī)理需要進(jìn)一步論證。

4 結(jié)論

研究結(jié)果表明，真菌竹黃中含有藥理作用相反的活性物質(zhì)，可以雙向調(diào)節(jié)TNF-α誘導(dǎo)的L929細(xì)胞凋亡過(guò)程。通過(guò)深入探索其干預(yù)TNF-α信號(hào)網(wǎng)絡(luò)平衡的作用機(jī)制，我們發(fā)現(xiàn)TNF-α信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白因子COX-2表達(dá)下降，BCL-2表達(dá)上調(diào)，而NF-κB基本沒(méi)有變化，推測(cè)COX-2和 BCL-2蛋白是竹黃拮抗細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白，相關(guān)研究為臨床上竹黃發(fā)揮抗腫瘤和抗炎功效提供理論基礎(chǔ)，也為運(yùn)用生物活性導(dǎo)向技術(shù)，結(jié)合天然藥物分離提純技術(shù)，進(jìn)行竹黃相關(guān)藥物的篩選提供依據(jù)。

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