HPLC法測定紅豆杉細胞培養(yǎng)物中的α-萘乙酸

黃巧明，駱雪蘭，徐國熙，李干雄，劉志偉

廣東科倫藥業(yè)有限公司研發(fā)部，廣東梅州 514031

萘乙酸是一種生長素類性質的生長調節(jié)劑，其毒性小，且具有明顯的增產(chǎn)效果，因此在農業(yè)上得到廣泛應用，但日本、美國對其在農產(chǎn)品的殘留均有嚴格的限量。紫杉醇是從紅豆杉植物中提取的一種抗癌藥，由于紅豆杉植物資源短缺，梅興國等采用紅豆杉植物細胞培養(yǎng)技術生產(chǎn)紫杉醇［1］，在其生產(chǎn)過程中添加萘乙酸對生物量具有明顯的促進效果，而且在鮮細胞和培養(yǎng)液中的紫杉醇產(chǎn)量均有所增加，因此萘乙酸在紅豆杉細胞培養(yǎng)中也作為一種調節(jié)劑。

目前，國內對萘乙酸在水稻、水果和蔬菜中的殘留檢測已有報道，檢測方法主要有分光光度法、氣相色譜法和高效液相色譜法等。本文采用了溶劑萃取前處理，高效液相色譜分離測定，分析了紅豆杉細胞培養(yǎng)物中的萘乙酸殘留狀況，結果準確可靠、靈敏度高，能符合農藥殘留的分析要求。

1 材料與方法

1.1 儀器和試藥

Waters 515高效液相色譜儀、Waters 2487紫外檢測器(美國Waters公司)，UV-2401 PC紫外分光光度計(日本島津公司)，旋轉蒸發(fā)儀。

對照品:萘乙酸純度為99%(國藥集團化學試劑有限公司);乙腈為色譜級試劑;水為超純水;二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、磷酸和磷酸二氫鉀為分析純試劑，紅豆杉細胞培養(yǎng)液和鮮細胞由本單位提供。

1.2 樣品的處理和制備

培養(yǎng)液樣品:將鮮細胞用200目濾布過濾，濾液即為紅豆杉細胞培養(yǎng)液。精密量取50 mL培養(yǎng)液，加入50 mL二氯甲烷萃取，共萃取三次，收集二氯甲烷溶液經(jīng)旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，用乙醇溶解洗脫并定容5 mL，搖勻待分析。

鮮細胞樣品:精確稱取鮮細胞10 g，加50 mL乙醇浸泡30 min，并用超聲波振蕩15 min，細胞用濾紙過濾，加50 mL乙醇重復超聲三次，合并濾液經(jīng)旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，加50 mL二氯甲烷和50 mL蒸餾水萃取，共萃取三次，二氯甲烷溶液減壓濃縮至干，用乙醇溶解洗脫并定容10 mL，搖勻待分析。

1.3 液相色譜條件

色譜柱:Nova-Pak C18柱(150 mm ×3.9 mm，5 μm);流速:1 mL/min;紫外檢測波長:281 nm;柱溫:30℃;流動相:體積比為50∶50的乙腈-水(0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液，用磷酸調PH值為3.0);進樣體積為 5 μL。

1.4 加標回收率

精密量取培養(yǎng)液50 mL加入萘乙酸25 mg/L的標準溶液1 mL，精密稱取鮮細胞10克加入萘乙酸2.5 mg/L的標準溶液1 mL，按上述方法進行前處理和制備，設置3組平行處理，進行加標回收率實驗，結果見表1。

表1 樣品中萘乙酸的回收率實驗結果(n=3)Table 1 Recovery results of α-Naphthylacetic acid in sample(n=3)

1.5 樣品的測定

分別平行處理和制備5組細胞和培養(yǎng)液樣品，依上述色譜條件，測定5組樣品，用外標標準曲線法計算樣品中的萘乙酸含量，結果見表2，對照品和樣品的色譜圖見圖(1)(2)(3)，萘乙酸(1號峰)保留時間2.43 min左右。

表2 樣品的測定結果(n=5)Table 2 Determination results of sample(n=5)

圖3 細胞色譜圖Fig.3 The chromatogram of NAA in cell

2 結果與討論

2.1 檢測波長的選擇

精密稱取萘乙酸對照品適量，用乙醇配制成含萘乙酸為10 mg/L的標準溶液，對萘乙酸標準溶液和上述制備的培養(yǎng)液供試品進行紫外光譜掃描，發(fā)現(xiàn)萘乙酸標準溶液在281 nm的波長處有較大紫外吸收峰，而培養(yǎng)液樣品在281 nm附近紫外吸收較小，為了減少雜質干擾，以達到較好的色譜分離，同時提高靈敏度，選擇檢測波長為281 nm。

2.2 前處理方法的建立

采用液液萃取法對樣品進行前處理，比較簡便快捷。對二氯甲烷和乙酸乙酯二種溶劑分別萃取樣品進行比較，實驗結果表明，所得回收率基本一致，但二氯甲烷萃取所得的樣品在色譜圖中雜質干擾較少，因此，實驗前處理方法采用二氯甲烷和水進行液液萃取。

2.3 流動相條件的優(yōu)化

據(jù)文獻［2］報道，采用流動相體積比為70∶30的甲醇-水(磷酸調PH值3.0)可使萘乙酸達到色譜分離，而本實驗試用了多種“甲醇-水”溶劑系統(tǒng)，萘乙酸均未能與樣品雜質達到色譜分離。而后，改用溶劑系統(tǒng)，通過多次實驗，結果以體積比50∶50的乙腈-水(0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液，用磷酸調PH值3.0)為流動相，萘乙酸峰與干擾組分達到良好的色譜分離，滿足了分析要求。

2.4 線性關系的考察

精密稱取萘乙酸對照品適量，用乙醇配制成含萘乙酸為500 mg/L的儲備液，再精密量取適量用乙醇依次稀釋成濃度分別為 0.20、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0 mg/L的標準溶液，在優(yōu)化實驗條件下進行液相色譜測定，萘乙酸的質量在0.001～0.125 μg范圍內與色譜峰面積呈良好的線性關系，其回歸方程為 Y=(3.092×107)X-21920.943(r=0.9998)，其中Y為色譜峰峰面積，X為萘乙酸的量(μg)。

2.5 精密度、檢測限和回收率試驗結果

精密量取萘乙酸標準溶液5 μL注入色譜儀，重復測定5次，其峰面積的RSD為0.52%。儀器的最低檢出量為(S/n=5)0.001 μg，根據(jù)樣品處理量計算，培養(yǎng)液的檢出限為0.02 mg/L，鮮細胞的檢出限為0.2 mg/kg。萘乙酸在鮮細胞和培養(yǎng)液樣品中的加標回收率實驗表明，在該方法條件下，鮮細胞和培養(yǎng)液樣品中分別加入萘乙酸對照品，其平均回收率分別為87%和93%。相對標準偏差RSD分別為3.9%和3.3%。

3 結論

本實驗方法經(jīng)過對樣品前處理方法和檢測波長的篩選，同時對流動相系統(tǒng)的優(yōu)化，建立了簡便、快速、靈敏、準確測定紅豆杉細胞培養(yǎng)物中萘乙酸的高效液相色譜法。本方法可以監(jiān)測紅豆杉細胞培養(yǎng)物中萘乙酸的殘留。同時，對于紅豆杉細胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇過程中控制生長激素水平也具有重要的意義。

1 Mei XG(梅興國).Taxol Production by Taxus Cell Culture(紅豆杉細胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇).Wuhan:Huazhong University of Science and Technology Publisher，2003.10-13.

2 Kong DY(孔德洋)，Shi LL(石利利)，Shan ZJ(單正軍)，et al.Determination of α-Naphthylacetic acid by ASE-GPC Coupled with HPLC.J instrum anal(分析測試學報)，2010，29:382-385.