非諾貝特對高脂模型大鼠過氧化物酶增殖物活化受體γ、肝X受體α和ABCA1 mRNA及其蛋白表達的影響

高麗君 齊曉勇 王秀萍 高俊茶 藺 杰 王 超 孫海平 馬艷凱

(河北省人民醫(yī)院心內科，河北 石家莊 050051)

動脈粥樣硬化(AS)發(fā)生與低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平呈正相關，在降低LDL-C的同時，升高高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)及增加逆膽固醇轉運(RCT)不僅能有效抗AS，還能有效逆轉 AS斑塊。ATP結合盒轉運體(ABCA1)是升高HDL-C及增加RCT的關鍵基因〔1〕。生理情況下，進入細胞內的膽固醇，特別是氧化型低密度脂蛋白膽固醇(ox-LDL)以及乙酰化低密度脂蛋白膽固醇(ac-LDL)均可通過肝臟X受體(LXRα)途徑調節(jié)ABCA1的表達〔2〕;過氧化物酶體增殖物活化受體γ(PPARγ)也可通過肝臟LXRα調節(jié)ABCA1基因的表達。非諾貝特是PPARα的配體，可升高HDL-C濃度，減少AS的形成。本文擬研究非諾貝特是否通過影響ABCA1基因的表達而發(fā)揮抗AS作用以及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 30只雄性健康 Wistar大鼠，體重100～120 g，2月齡，購自河北醫(yī)科大學實驗動物中心，合格證編號708160。適應性喂養(yǎng)1 w后，測量體重及血脂水平。隨機分為3組:正常對照組10只、高脂模型對照組10只、非諾貝特藥物干預組10只。全部動物均在同一實驗室按清潔級大鼠要求專人飼養(yǎng)，自由進食水。實驗過程符合中華人民共和國的《實驗動物管理條例》及倫理要求。

1.2 實驗方法 應用RT-PCR方法測量各組肝臟和血管中PPARγ mRNA，LXRα和ABCA1 mRNA的表達。應用Western印跡方法測量肝臟和血管中PPARγ，LXRα和ABCA1蛋白的表達。

2 結果

2.1 非諾貝特對大鼠肝臟、血管PPARγ mRNA及蛋白表達的影響 高脂模型組肝臟PPARγ mRNA及蛋白表達水平分別為0.18±0.01和0.35±0.01，與正常對照組(0.17±0.01和0.32±0.01)相比雖然有輕度的升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。主動脈PPARγ mRNA及蛋白表達水平較正常對照組分別提高了1.21倍和1.15倍，與正常對照組(0.29±0.02和0.20±0.00)相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。非諾貝特藥物干預后大鼠肝臟的PPARγ mRNA為0.27±0.02，主動脈PPARγ mRNA為0.39±0.02，與模型組比較雖有升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);大鼠肝臟PPARγ蛋白表達為0.39±0.02，主動脈PPARγ蛋白表達為0.26±0.01，表達水平有不同程度的升高，變化趨勢與mRNA的表達趨勢一致。見圖1～圖4。

2.2 非諾貝特對大鼠肝臟、血管LXRα mRNA及蛋白表達的影響 高脂模型組大鼠肝臟、主動脈的LXRα mRNA及蛋白表達水平與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。非諾貝特藥物干預后大鼠肝臟LXRα mRNA為0.60±0.08，主動脈LXRα mRNA為0.82±0.07，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);大鼠肝臟LXRα蛋白表達為0.34±0.01，主動脈LXRα蛋白表達為0.41±0.01，表達水平均升高，變化趨勢與mRNA的表達趨勢一致。見圖1～圖4。

圖1 各組大鼠肝臟PPARγ、LXRα、ABCA1 mRNA表達

圖2 各組大鼠主動脈PPARγ、LXRα、ABCA1 mRNA表達

圖3 各組大鼠肝臟PPARγ、LXRα、ABCA1蛋白表達

圖4 各組大鼠主動脈PPARγ、LXRα蛋白表達

2.3 非諾貝特對肝臟、血管ABCA1 mRNA和蛋白表達的影響高脂模型組肝臟ABCA1 mRNA及蛋白表達水平分別為0.65±0.08和0.28±0.01，與正常對照組(0.55±0.03和0.25±0.01)相比雖然有輕度的升高，但無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，主動脈ABCA1 mRNA及蛋白表達水平分別提高了1.157倍和1.16倍，與正常對照組(0.57±0.06和0.25±0.01)相比無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。非諾貝特藥物干預后大鼠肝臟ABCA1 mRNA為0.90±0.08，主動脈ABCA1 mRNA為1.08±0.09，較模型組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);大鼠肝臟ABCA1蛋白表達為0.50±0.02，主動脈ABCA1蛋白表達為0.51±0.02，表達水平有不同程度的升高，與模型組相比具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。見圖1～圖3。

3 討論

AS是一種多因素參與的疾病，其病因尚不完全清楚。大量膽固醇脂在巨噬細胞內積聚，形成泡沫細胞，這是AS形成早期的特征性病理生理過程。研究表明HDL-C通過參與膽固醇逆轉運(RCT)發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用，與AS、冠心病發(fā)病危險呈負相關。HDL-C的AS保護作用的關鍵機制是膽固醇逆轉運(RCT)，已經證明ABCA1的主要作用是將細胞內膽固醇和磷脂轉運至細胞膜外并與apoA-I相結合，形成新生HDL顆粒，啟動RCT過程。因此，ABCA1在RCT和HDL-C生成的起始步驟中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，ABCA1的表達水平與血漿中HDL水平相關 ，即ABCA1表達增加，血漿中HDL水平隨之增加〔3〕。本研究結果表明，建立模型后，HDL-C升高和ABCA1輕度升高，原因如下:考慮血脂增高后，刺激膽固醇外流，增加巨噬細胞和成纖維細胞內膽固醇含量可顯著增加ABCA1的表達并提高載脂蛋白介導的脂質流出。除了膽固醇外，氧化固醇也明顯誘導巨噬細胞ABCA1表達。ABCA1途徑受損與動脈粥樣硬化性炎癥和代謝紊亂有關，所以ABCA1通路是治療心血管疾病的靶點。

非諾貝特屬于氯貝丁酸衍生物類血脂調節(jié)藥，通過抑制ox-LDL和TG的生成并同時使其分解代謝增多，降低血LDL-C、TC和TG;非諾貝特還通過減少膽固醇脂轉移蛋白的表達升高高密度脂蛋白。吳信超等〔4〕認為使用非諾貝特治療，降低甘油三酯有效率為90%，降低膽固醇為74%，增加高密度脂蛋白為67%。說明非諾貝特主要是降低甘油三酯，并兼有降低膽固醇和升高HDL-C作用，貝特類還可誘導HDL受體(如SR-B1/CLA-1和ABCA1)過分表達，從而增加細胞膽固醇外流，所以，貝特類可通過增加“逆向膽固醇轉運”而減少動脈硬化。本研究表明，非諾貝特能降低甘油三酯，升高HDL-C，能升高ABCA1的表達，可能一種機制是通過對脂質、脂蛋白的影響，其機制尚需進一步探討。本實驗顯示:ABCA1 mRNA和蛋白質的分布并不總一致的，說明存在著轉錄后的調控，在培養(yǎng)的巨噬細胞中，ABCA1 mRNA和蛋白質以很快的速度降解，而apoA-Ⅰ和apoA-Ⅱ阻止了THP-1細胞中的ABCA1降解，與HDL無關。說明存在一種穩(wěn)定調節(jié)ABCA1表達的因子，具體機制有待探討。目前研究比較多的在轉錄水平上調節(jié)ABCA1的因子就是肝X受體/視黃醇X受體(LXRα/RXR)。當配體與它們結合后，核受體LXR和RXR形成異源二聚體，受氧化膽固醇和視黃酸所激活，然后結合到ABCA1啟動子的識別序列DR-4上，增強ABCA1基因的轉錄。通過對LXR/RXR與ABCAI的基因啟動子相結合研究表明，利用LXR/RXR途徑可促進ABCA1基因的轉錄，促進外周細胞內膽固醇流出，防止泡沫細胞的形成，從而可以防治AS。

PPARs屬于核激素受體超家族成員。研究發(fā)現(xiàn)PPARs有α、β、γ三種亞型，可以通過與LXR或RXR結合，進一步調節(jié)如ABCA1等的靶基因的表達。PPARγ通過調控靶基因的表達，增加ABCA1的表達，對動脈粥樣硬化有抑制作用。近來研究發(fā)現(xiàn)，PPAR-γ的人工合成配體羅格列酮能上調ABCA1蛋白的表達〔5〕，實驗研究可能通過PPAR-LXR-ABCA1路徑而實現(xiàn)。因此，PPAR-α和PPAR-γ激動劑很可能是間接通過活化LXR/RXR途徑來上調ABCA1基因轉錄的，通過上調LXR-α促進膽固醇逆轉運蛋白的轉錄，加速膽固醇逆轉運出巨噬細胞而發(fā)揮抗AS作用〔3〕。PPARγ還具有促進巨噬細胞凋亡，抑制一些炎性因子的作用，并可抑制內皮素的釋放，誘導內皮細胞釋放利鈉肽，使血管擴張、改善血管張力發(fā)揮其抗AS的作用繼而減輕斑塊的形成，可能對AS的防治具有重要意義。

本實驗顯示了應用非諾貝特后，肝臟和血管ABCA1升高，同時LXRα明顯升高，但PPARγ無明顯升高，表明他的作用可能是通過其他途徑實現(xiàn)。PPAR是配體倚賴的轉錄因子，是細胞核激素受體超家族中的一員，在眾多的細胞轉錄調控中起重要作用，PPARα主要調節(jié)脂質代謝和炎癥調控，是貝特類的分子靶標。延長非諾貝特作用時間以及提高非諾貝特藥物濃度都可引起冠心病患者外周血 ABCA1基因表達上調，同時PPARα的表達也上調，作用于LXR/RXR途徑，從而引起人ABCA1轉錄過程的加強。

很多文獻研究許多ABCA1基因的調節(jié)因素，但是大部分的機制目前尚不太清楚，而且大多處于動物實驗階段，需要進一步闡明人的ABCA1基因的調節(jié)機制。深入研究ABCA1的功能及其表達的調控機制，無論對于脂代謝、AS、冠心病的治療，還是針對這一環(huán)節(jié)的新藥開發(fā)，都具有十分重要的意義。

1 Soro-Paavonen A，Naukkarinen J，Lee-Rueckert M，et al.Common ABCA1 variants，HDL levels，and cellular cholesterol efflux in subjects with familial low HDL〔J〕.J Lipid Res，2007;48(6):1409-16.

2 Attie AD.ABCA1:at the nexus of cholesterol，HDL and atherosclerosis〔J〕.Trends Biochem Sci，2007;32(1):172-9.

3 Hossain MA，Tsujita M，Gonzalez FJ，et al.Effects of fibrate drugs on expression of ABCA1 and HDL biogenesis in hepatocytes〔J〕.J Cardiovasc Pharmacol，2008;51(2):258-66.

4 吳信超，王曉霞.微?；侵Z貝特治療49例高脂血癥療效觀察〔J〕.人人健康(醫(yī)學導刊)，2008;20(2):16-7.

5 茍連平，呂 湛，秦 儉.腺苷三磷酸結合盒轉運蛋白A1在動脈粥樣硬化中的作用及其受控特點〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復，2007;11(10):1943-6.