水通道蛋白3在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及與臨床病理相關(guān)性的研究

李白翎 金磊 鐘鏗 杜大海

水通道蛋白（aquaporins, AQPs）是一組分子量約30 kDa的（單體）疏水性膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，屬于主要固有蛋白（major intrinsic protein, MIP）家族[1]。近年來，AQPs的表型及臨床病理相關(guān)研究取得了重大進(jìn)展[2]。其中AQPs的染色體定位、基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)調(diào)控、蛋白構(gòu)象、組織分布和生理功能方面研究較為深入，但AQPs功能對腫瘤的影響至今尚未明確。最近研究[3]發(fā)現(xiàn)AQP3在腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成中發(fā)揮了重要的作用。已有研究[4]證實(shí)AQP3在多種不同來源的腫瘤中表達(dá)水平較高，尤其是在侵襲性強(qiáng)的腫瘤中。但AQP3在非小細(xì)胞肺癌（nonsmall cell lung cancer, NSCLC）組織中的表達(dá)及與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系，國內(nèi)外鮮有報(bào)道。本研究應(yīng)用免疫組化法檢測NSCLC中AQP3的表達(dá)情況，并分析其與微血管密度（micro vascular density, MVD）及臨床病理參數(shù)間的相關(guān)性，為進(jìn)一步研究AQP3在NSCLC發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2006年1月-2006年12月上海長海醫(yī)院胸心外科手術(shù)切除的NSCLC標(biāo)本180例，術(shù)前未行任何抗腫瘤治療；其中男性117例，女性63例?；颊吣挲g43歲-79歲，平均年齡54.7歲。病理分型為鱗癌64例，腺癌99例，大細(xì)胞癌10例，其它病理類型7例。所有標(biāo)本均經(jīng)過病理組織學(xué)診斷證實(shí)，癌旁組織作為對照組。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 AQP3免疫組化試劑盒購自美國 Santa Cruz公司；即用型SABC試劑盒及DAB顯色劑購自武漢博士德公司，CD34單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2.2 免疫組織化學(xué)分析 免疫組化染色采用SABC（streptavidin-biotin complex）法，高溫抗原修復(fù)，染色程序參照說明書進(jìn)行。用已知陽性切片作為陽性對照，用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照。

1.3 結(jié)果判定 采用雙盲法，由兩位病理科醫(yī)師分別讀片。AQP3陽性判斷：在胞膜、胞漿呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)不同視野計(jì)數(shù)，結(jié)果取其平均值。AQP3免疫組化評分方法：選擇5個(gè)高倍視野（×200）計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)和陽性細(xì)胞數(shù)，得出陽性細(xì)胞百分率，其中：陽性細(xì)胞數(shù)＜ 5%為陰性，計(jì)0分；5%-25%為弱陽性，計(jì)1分；26%-50%為中等強(qiáng)度陽性，計(jì)2分；＞50%為強(qiáng)陽性，計(jì)3分。按染色強(qiáng)度：弱為0分，中為1分，強(qiáng)為2分，共3級。總評分值=陽性細(xì)胞比例評分+染色強(qiáng)度評分；總評分值≤2分為陰性，3分-4分為中等強(qiáng)度陽性（+），5分-6分為強(qiáng)陽性（++）。

1.4 MVD計(jì)數(shù) 采用CD34染色計(jì)數(shù)MVD值。CD34定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞膜和胞漿，陽性者呈棕色。腫瘤MVD計(jì)數(shù)按照Weidner[5]方法進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。采用方差分析（方差齊LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊Tamhane檢驗(yàn)）比較不同組織中AQP3蛋白陽性染色結(jié)果總評分，率的比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC組織、癌旁組織中AQP3的表達(dá) AQP蛋白陽性表達(dá)主要定位于胞膜、胞漿，呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色。正常肺組織中，AQP3分布于肺泡II型上皮細(xì)胞、氣道粘液上皮細(xì)胞胞質(zhì)和頂膜及部分粘液腺細(xì)胞基底。免疫組化結(jié)果顯示：NSCLC組織中AQP3陰性表達(dá)率為13.9%（25/180），中等強(qiáng)度陽性表達(dá)率為37.2%（67/180），強(qiáng)陽性表達(dá)率為48.9%（88/180）。NSCLC組織中AQP3表達(dá)高于癌旁組織（圖1），有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。

2.2 MVD與AQP3表達(dá)的相關(guān)性研究 CD34染色定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞，呈棕黃色。腫瘤間質(zhì)中見大量血管內(nèi)皮細(xì)胞陽性染色，微血管分布不均（圖2）。NSCLC組織中MVD計(jì)數(shù)為51.2±21.6，明顯高于癌旁組織15.2±3.1（P＜0.01）。根據(jù)AQP3在NSCLC中的不同表達(dá)水平，分析其對MVD計(jì)數(shù)的影響，研究其相關(guān)性（表1）。結(jié)果顯示AQP3的表達(dá)與MVD表達(dá)密切相關(guān)，AQP3高表達(dá)的同時(shí)伴隨著MVD計(jì)數(shù)增高（P＜0.01）。

2.3 NSCLC組織中AQP3的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系表2顯示了AQP3表達(dá)和NSCLC臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。男性患者AQP3中等強(qiáng)度表達(dá)37例（31.6%），強(qiáng)陽性表達(dá)65例（55.6%），明顯高于女性患者（P=0.003）。與鱗癌相比，腺癌中AQP3表達(dá)水平明顯較高，其中中等強(qiáng)度表達(dá)29例（29.2%），強(qiáng)陽性表達(dá)65例（65.7%）（P＜0.001）；并且，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例往往伴隨著AQP3的高表達(dá)（P=0.026）。NSCLC中AQP3的表達(dá)與腫瘤分化程度呈明顯正相關(guān)，表現(xiàn)為AQP3的陽性表達(dá)率在高分化癌中明顯高于低分化癌（P＜0.001）。但AQP3的表達(dá)情況與年齡、TNM分級等無相關(guān)性（P＞0.05）。

表 1 MVD與AQP3表達(dá)的相關(guān)性分析Tab 1 MVD according to the combination of AQP3 expressions

圖 1 AQP3在NSCLC及癌旁組織中的表達(dá)（SABC, ×200）Fig 1 Expression of AQP3 in NSCLC and adjacent tissues (SABC, ×200). NSCLC: nonsmall cell lung cancer.

圖 2 肺癌及癌旁組織中的MVD計(jì)數(shù)（SABC, ×200）Fig 2 The MVD counts in NSCLC and adjacent tissues (SABC, ×200)

表 2 NSCLC中AQP3的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系Tab 2 AQP3 expression and clinicopathological factors in NSCLC

3 討論

AQP是一種內(nèi)在膜蛋白， AQP3是AQP家族成員之一，是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)的除了對水有通透性以外，還能夠通透甘油和尿素的AQP。最新研究[6]發(fā)現(xiàn)AQP3參與了腫瘤的血管生成過程。人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)起源于腦、胃、腎、結(jié)直腸等至少12種不同來源的人類腫瘤細(xì)胞有AQP3表達(dá)[1]，本研究結(jié)果顯示人類NSCLC細(xì)胞亦存在AQPs家族中的AQP3高表達(dá)，臨床病理分析表明AQP3 可能參與NSCLC的血管生成。

惡性腫瘤基本的生物學(xué)特征為腫瘤細(xì)胞的無限增殖和分化異常。為滿足快速增殖、分裂和侵襲轉(zhuǎn)移的需要，腫瘤細(xì)胞比正常細(xì)胞更需要水分子的快速跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。多數(shù)惡性腫瘤有很高的組織間隙液體壓力和微血管滲透性，細(xì)胞內(nèi)外滲透壓變化頻率加快，這在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中具有重要作用[7]。AQP3表達(dá)或功能的改變不僅對水分子的運(yùn)輸產(chǎn)生明顯影響，而且對細(xì)胞的生命活動(dòng)至關(guān)重要。有研究[8]表明敲除AQP3基因，小鼠內(nèi)皮細(xì)胞遷移速度明顯降低，從而引起腫瘤血管生成障礙，腫瘤生長受抑制，提示AQP3與腫瘤血管生成及腫瘤生長、擴(kuò)散有關(guān)。AQP3可以通過兩種途徑間接刺激腫瘤血管增生：①它與血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）起協(xié)同作用，使腫瘤血管具有很高的通透性，并且加強(qiáng)纖維素外滲，加強(qiáng)了內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，而這兩種細(xì)胞功能促進(jìn)了腫瘤血管生成和發(fā)展；②AQP3介導(dǎo)的高滲透性引起流體靜力壓的增高，并且隨之引起缺氧，刺激血管生成[9]。

本研究對180例NSCLC標(biāo)本進(jìn)行了免疫組織化學(xué)分析；其中鱗癌64例，腺癌99例，大細(xì)胞癌10例，其它病理類型7例。研究發(fā)現(xiàn)，腺癌中AQP3強(qiáng)陽性率最高（65.7%），而鱗癌為35.9%，大細(xì)胞癌未檢測到AQP3強(qiáng)陽性表達(dá)。因此表明，AQP3在肺組織的表達(dá)不僅具有細(xì)胞特異性，而且還具有腫瘤組織類型特異性。另外，對NSCLC腫瘤分化程度與AQP3表達(dá)關(guān)系的研究表明，高分化癌組織AQP3表達(dá)較多，低分化癌表達(dá)少。由于不同類型肺癌在腫瘤演進(jìn)過程中可能存在著不同機(jī)制，有研究[10]認(rèn)為肺腺癌與肺鱗癌在生物學(xué)行為上的不同可能是基因表達(dá)上的差異。我們的研究發(fā)現(xiàn)AQP3的表達(dá)與臨床病理特征存在相關(guān)，因此認(rèn)為AQP3表達(dá)的明顯差異可能是肺腺癌較鱗癌更容易轉(zhuǎn)移的原因。AQP3的表達(dá)可能與肺腺癌關(guān)系更密切。目前，腫瘤的微血管密度被用于提示腫瘤血管生成的數(shù)量，是衡量腫瘤血管形成程度的定量指標(biāo)，可以提示腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移潛能以及遠(yuǎn)期生存率，并被認(rèn)為與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有著密切的關(guān)系[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，CD34不同程度地表達(dá)于NSCLC及癌旁正常組織，兩組之間的差異明顯，相關(guān)性分析表明AQP3與MVD在NSCLC組織中的表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.01），說明AQP3在NSCLC的新生血管形成過程中起著非常重要的作用，而在腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移過程中，血管的生成又為其提供了必須的物質(zhì)基礎(chǔ)和轉(zhuǎn)移通道[12]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，男性患者AQP3表達(dá)高于女性患者（P=0.003）。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例中存在AQP3高表達(dá)（P=0.026）。NSCLC中AQP3的陽性率與腫瘤分化程度呈明顯正相關(guān)，表現(xiàn)為AQP3的陽性率在高分化癌中明顯高于低分化癌（P＜0.001）。但AQP3的表達(dá)情況與年齡、病理分級等無相關(guān)性（P＞0.05）。既往研究[13]發(fā)現(xiàn)AQP3作為水通道中的水甘油通道參與一系列重要的物質(zhì)代謝過程，在維持細(xì)胞的能量平衡中起一定作用，從而推測腫瘤細(xì)胞的能量供應(yīng)、生物大分子合成等生理活動(dòng)均有AQP3參與。有報(bào)道[14]提示，野生型小鼠與AQP3基因敲除小鼠相比，更易患腫瘤，因?yàn)锳QP3缺失的小鼠的表皮細(xì)胞中甘油、3-磷酸甘油及ATP含量下降，從而使細(xì)胞增殖能力下降，減少了腫瘤發(fā)生的可能，以上研究均支持AQP3在腫瘤細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移過程能量供應(yīng)方面發(fā)揮了重要的作用。

綜上所述，本研究表明，AQP3高表達(dá)與肺癌病理組織學(xué)類型、腫瘤分化程度、腫瘤性血管新生、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床特征相關(guān)。AQP3在NSCLC中的高表達(dá)可能對腫瘤血管生成起到了促進(jìn)和維持的作用。因此，對AQP3的研究有助于理解肺癌組織中水電解質(zhì)平衡的復(fù)雜過程，其確切機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。