基因富集及meta分析篩選非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展關(guān)鍵基因的研究

何文武 冼磊 王永勇 胡艷玲 陳銘伍

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是全球最常見惡性腫瘤之一，2011年最新在線出版的全球癌癥統(tǒng)計[1]表明，肺癌是男性中最常見的癌癥，也是男性死亡最常見的病因；在女性常見的癌癥中，排在第4位，也是第2位死亡病因。隨著腫瘤發(fā)病機(jī)制及其生物學(xué)行為研究的不斷深入，越來越多的焦點聚向了以特異性高、不良反應(yīng)輕為特點的分子靶向治療。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中有大量疾病關(guān)鍵基因和伴隨基因參與癌基因的擴(kuò)增過程，但是如何將影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵性分子改變從伴隨性改變中識別出來是目前腫瘤研究領(lǐng)域的重要挑戰(zhàn)之一。近年來隨著人類基因組測序工程的完成，研究者開始把基因芯片廣泛應(yīng)用于腫瘤學(xué)研究，通過改變實驗條件或?qū)嶒灅?biāo)本對全基因組mRNA的表達(dá)使用基因芯片進(jìn)行檢測，得到了無數(shù)基因芯片數(shù)據(jù)，繼而產(chǎn)生了基因芯片數(shù)據(jù)庫（gene expression omnibus, GEO）[2]。但是如何挖掘出與疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的關(guān)鍵基因作為治療疾病的靶點，仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)。為了能解決這個問題，Subramanian等[3]提出基因組富集（gene set enrichment analysis, GSEA）分析，該方法能在病例對照類型數(shù)據(jù)中基于基因組系統(tǒng)水平挖掘影響疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因通路。通過分析一組處于2種生物學(xué)狀態(tài)的基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)，了解他們在特定功能基因集中的表達(dá)狀況以及這種表達(dá)狀況是否存在某種統(tǒng)計學(xué)意義。另外，因為實驗平臺、樣本、標(biāo)化方法、分析方法等問題的存在，不同實驗室的芯片數(shù)據(jù)有很多的差異，元分析（meta-analysis, meta）是一種可行的解決方法，可對同一個問題所發(fā)表相關(guān)研究報告的結(jié)果進(jìn)行收集、統(tǒng)計上的整合，以期獲得更準(zhǔn)確或更多的結(jié)果[4]。考慮通過探索人類NSCLC形成過程中共同擁有的基因改變，可能篩選出影響NSCLC發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因，因此本研究應(yīng)用GSEA和meta分析方法對標(biāo)準(zhǔn)化以后的3套NSCLC全基因組表達(dá)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，期望篩選出可能影響NSCLC發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵通路和基因，為NSCLC發(fā)病機(jī)制的研究提供重要的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究設(shè)定搜索關(guān)鍵詞為“non-small cell lung cancer”，限制研究類型為“expression profiling by array”，在GEO數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.gov/geo/）中搜索，結(jié)果提供與NSCLC有關(guān)的全基因組表達(dá)芯片數(shù)據(jù)有114套。制定數(shù)據(jù)集的納入標(biāo)準(zhǔn)為：①數(shù)據(jù)集必須是有文獻(xiàn)支持的全基因組mRNA表達(dá)芯片數(shù)據(jù)；②每套數(shù)據(jù)均有NSCLC癌組織和正常組織對照；③本次均考慮原始或者經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)集；④每套數(shù)據(jù)集必須包括3個以上樣本；⑤數(shù)據(jù)集采用的樣本必須是人體肺組織。最后，只有3套樣本數(shù)據(jù)集納入研究（表1）。

表 1 5套全基因組數(shù)據(jù)集的基本情況Tab 1 Characteristics of datasets selected in the studies

1.2 方法 GSEA方法通過分析2組以上的樣本之間差異表達(dá)基因，對樣本進(jìn)行聚類以獲得明顯基因表達(dá)差異的樣本分類。用R語言來處理數(shù)據(jù)，進(jìn)行統(tǒng)計分析，得到數(shù)據(jù)共同改變的通路。 meta方法對單套數(shù)據(jù)集進(jìn)行t檢驗，將結(jié)果行meta分析，得到差異表達(dá)的基因，放入可視化綜合發(fā)現(xiàn)注解數(shù)據(jù)庫（The Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery, DAVID）網(wǎng)站得到這些基因可能所在的通路。首先通過Bioconductor[8]的2.10.1版本來對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。用軟件包affty中的RMA算法[9,10]對affymetrix平臺的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行背景校正、標(biāo)準(zhǔn)化和Log2轉(zhuǎn)換。然后對每一套數(shù)據(jù)每個探針的檢驗采用成組t檢驗，僅選取在日本基因和基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG）數(shù)據(jù)庫[11]中存在的基因進(jìn)行GSEA分析，剔除變異四分位距＜0.5的基因，如果一個基因?qū)?yīng)幾個探針，只保留變異內(nèi)距（inter-quartile range,IQR）最高的探針。 GSEA通過Bioconductor的category包進(jìn)行，只有超過10個基因的類保留，通過t檢驗對每一個通路中的基因進(jìn)行檢驗，通過1,000次循環(huán)的排列組合（permutation）獲得每個通路的P值，運用SAS 9.13軟件，通過t檢驗把3套數(shù)據(jù)共同通路里的每個探針?biāo)愠鯬值，再通過公式[12]（自由度為數(shù)據(jù)集K的2倍）算出每個基因的卡方值，最后保留P＜0.05的基因。對這些基因通路的分析通過DAVID （http://david.abcc.ncifcrf.gov）中的KEGG庫進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 GSEA分析 應(yīng)用GSEA方法對3套數(shù)據(jù)集進(jìn)行功能基因富集， GSE19188數(shù)據(jù)集富集出上調(diào)通路139條，下調(diào)通路40條；GSE7670數(shù)據(jù)集富集出上調(diào)通路106條，下調(diào)通路24條；GSE18842數(shù)據(jù)集富集出上調(diào)通路112條，下調(diào)通路57條。其中數(shù)據(jù)集GSE19188和數(shù)據(jù)集GSE18842通路重疊性比較高。通過3組數(shù)據(jù)中所得通路進(jìn)行對比，上調(diào)中皆有的通路87條，下調(diào)中皆有的通路22條。

2.2 meta分析 運用成組t檢驗對3套數(shù)據(jù)集單獨分析得出每個基因的P值后， 通過軟件SAS 9.13運用選擇的meta公式進(jìn)行整合分析，共篩出1,177個基因（P＜0.05）。通過DAVID的KEGG庫進(jìn)行通路富集，這1,177個基因中有162個基因能夠在KEGG庫中被篩出，主要分布在下面的19條通路中：癌癥通路（pathways in cancer）、粘著斑通路（focal adhesion）、細(xì)胞骨架肌動蛋白調(diào)控通路（regulation of actin cytoskeleton）、胞吞作用通路（endocytosis）、Fc-γ-R介導(dǎo)吞噬作用通路（Fc gamma R-mediated phagocytosis）、胰島素信號通路（insulin signaling pathway）、溶酶體通路（lysosome）、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移信號通路（leukocyte transendothelial migration）、粘著連接通路（adherens junction）、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路（neurotrophin signaling pathway）、細(xì)胞外基質(zhì)受體作用通路（ECM-receptor interaction）、前列腺癌通路（prostate cancer）、長期增強(qiáng)作用通路（long-term potentiation）、腎細(xì)胞癌通路（renal cell carcinoma）、精氨酸和脯氨酸代謝通路（arginine and proline metabolism）、致病大腸桿菌感染通路（pathogenic Escherichia coli infection）、神經(jīng)膠質(zhì)瘤通路（glioma）、膀胱癌通路（bladder cancer）、蛋白酶復(fù)合體通路（proteasome）。

2.3 兩種方法所得結(jié)果分析 應(yīng)用GSEA和meta兩種方法得到重疊性較高的通路：粘著斑通路（圖1）和細(xì)胞骨架肌動蛋白調(diào)控通路（圖2），且該兩條重要通路都屬于上調(diào)通路。 通過R命令語言，得到3組數(shù)據(jù)集里粘著斑通路和細(xì)胞骨架肌動蛋白調(diào)控通路各自所含基因探針號。將探針號傳至DVID（http://david.abcc.ncifcrf.gov/conversion.jsp）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行官方名稱轉(zhuǎn)換，得到3組數(shù)據(jù)里該通路所含的基因名稱。 GSE19188里在粘著斑通路所含差異基因152個， GSE7670含135個， GSE18842含152個；GSE19188里在細(xì)胞骨架肌動蛋白調(diào)控通路所含差異基因141個， GSE7670含118個， GSE18842含135個。通過上步meta運行結(jié)果可得粘著斑通路中差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）的基因31個，細(xì)胞骨架肌動蛋白調(diào)控通路中差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）的基因32個（表2）。

圖 1 粘著斑通路示意圖（圖片來源于從DAVID富集出中的KEGG數(shù)據(jù)庫http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?map04510，★P＜0.05且在該通路中的基因）Fig 1 Focal adhesion pathway (The chart is from KEGG database, http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?map04510, ★P＜0.05)

3 討論

隨著基因芯片研究的廣泛開展，對基因芯片數(shù)據(jù)的分析成為了基因芯片研究的重要部分?；蚋患椒ㄍㄟ^分析一組處于兩種不同生物狀態(tài)（如正常和癌變）的芯片數(shù)據(jù)，推斷已表達(dá)的基因是否有共同的表達(dá)趨勢，以此來找出與疾病關(guān)聯(lián)的基因和通路[13]。單獨對某次實驗結(jié)果進(jìn)行分析，且只是對單個基因進(jìn)行分析，由于樣本問題，可能會漏掉很多有用的信息；并且對基因芯片單套的t檢驗有一定的局限性，受到樣本量的限制，導(dǎo)致不可信的變異估計，可產(chǎn)生較高的假陽性，忽略了不同樣本中表達(dá)水平的差異[14]。本研究結(jié)合GSEA和meta兩種方法對該3套數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，兩種結(jié)果重疊對比，找出了影響NSCLC相關(guān)的重要基因和通路，最終得到重疊性較高的粘著斑通路和細(xì)胞骨架肌動蛋白調(diào)控通路以及差異性明顯的重要基因。粘著斑是細(xì)胞骨架的一個重要結(jié)構(gòu)，由細(xì)胞膜外的粘附素、細(xì)胞膜上的整聯(lián)蛋白和細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞骨架蛋白等相互連接集聚而成。細(xì)胞正是依靠“粘著斑”這種特殊結(jié)構(gòu)將細(xì)胞嵌合在體內(nèi)正確位置，從而保持細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)并發(fā)揮其正常功能[15,16]。另外，細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與基底膜之間的連接都與細(xì)胞骨架蛋白相連，細(xì)胞骨架功能的變化可以導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞-細(xì)胞間和細(xì)胞-基底膜粘附狀態(tài)的改變；同時，細(xì)胞-細(xì)胞間和細(xì)胞-細(xì)胞基底膜粘附功能狀態(tài)的變化通過細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制導(dǎo)致骨架蛋白的重新排列，最終引起內(nèi)皮通透性的改變。內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)變化和收縮性的改變主要受骨架蛋白如肌動蛋白和肌球蛋白的影響。內(nèi)皮細(xì)胞收縮性的改變被認(rèn)為是不同的信號和機(jī)制導(dǎo)致通透性變化的最后共同通路。目前已有多項研究[17]顯示，蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）與激動蛋白（actin）的結(jié)合可以激活PKC，PKC的激活促進(jìn)粘著斑的形成，其機(jī)制包括增加粘著斑激酶（FAK）的活性、促進(jìn)整合素的堿性化以及調(diào)節(jié)其它相關(guān)蛋白的功能等。其次，在我們篩選出的粘著斑通路31個差異基因和細(xì)胞骨架肌動蛋白調(diào)控通路32個差異基因中，兩條通路共有且P＜0.01的基因有ACTN2、ITGB6、Itgb5、MAPK1、MYL12A、MYL9、Pdgfb、SPDYA、actn4、pdgfra等，預(yù)測這10個基因可能與NSCLC的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系。通過查找文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)MAPK1[18]、Pdgfb[19]和pdgfra[20]與NSCLC發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，余下的7個基因沒有找到其與NSCLC的相關(guān)報道。我們還通過KEGG通路數(shù)據(jù)庫、P＜0.05以及文獻(xiàn)報道找出粘著斑通路中起關(guān)鍵作用的基因有ECM、ITGB、PKC、PTEN、ERK1/2、JNK、GF、RTK等，細(xì)胞骨架肌動蛋白調(diào)控通路中起關(guān)鍵作用的基因有ERK、GF、RTK、Ras、Rac等，這些基因均與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切的關(guān)系，并且其中部分基因與NSCLC的發(fā)生發(fā)展具有密切的關(guān)系，后續(xù)將通過實驗來驗證其與NSCLC發(fā)生發(fā)展之間的具體聯(lián)系。

圖 2 細(xì)胞骨架肌動蛋白調(diào)控通路示意圖（圖片來源于從DAVID富集出中的KEGG數(shù)據(jù)庫http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?map04810，★P＜0.05且在該通路中的基因）Fig 2 Regulation of actin cytoskeleton (The chart is from KEGG database, http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?map04810, ★P＜0.05 )

表 2 粘著斑通路和細(xì)胞骨架肌動蛋白調(diào)控通路中meta分析基因分布Tab 2 The gene distribution of focal adhesion and regulation of actin cytoskeleton pathways by meta-analysis

本研究對GEO基因芯片數(shù)據(jù)庫目前能找到且已有文獻(xiàn)支持的人類肺組織標(biāo)本全基因組表達(dá)芯片進(jìn)行了研究，已篩選出可能與NSCLC的發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)系的基因和通路，但是基因和通路的數(shù)量過多，這可能與數(shù)據(jù)集數(shù)量以及所包含的標(biāo)本量有關(guān)，并且本研究所得結(jié)果仍然只是運用生物信息學(xué)對NSCLC發(fā)生發(fā)展的重要基因和通路的預(yù)測，后續(xù)研究小組將對這些差異明顯的基因進(jìn)行生物功能學(xué)的驗證，以求從根本上發(fā)現(xiàn)與NSCLC發(fā)生發(fā)展相關(guān)的重要基因和通路，為NSCLC發(fā)病遺傳機(jī)制及靶向治療的研究奠定科學(xué)基礎(chǔ)。