穿心蓮內(nèi)酯對人鼻咽癌細胞增殖以及Na+-K+-ATP酶活性的影響

王柏琦 程愛蘭

穿心蓮內(nèi)酯對人鼻咽癌細胞增殖以及Na+-K+-ATP酶活性的影響

王柏琦 程愛蘭

目的 觀察穿心蓮內(nèi)酯(Andrographolide, AD)對人鼻咽癌CNE-2細胞的生長抑制作用，并研究其對凋亡的作用機制。方法 體外培養(yǎng)CNE-2細胞，分別用1.0mmol/L、3.0mmol/L、5.5μmol/L的AD處理細胞24h、48h、72h。CCK-8法檢測細胞的增殖抑制率；流式細胞術分析細胞周期的變化；無機磷法檢測Na+-K+-ATP酶活性改變。結果 AD能顯著抑制CNE-2細胞的增殖，使其細胞周期停滯于S期和G2/M期；不同濃度的AD能降低Na+-K+-ATP酶活性且呈劑量依賴性，即當AD濃度為1.0μmol/L時，能使酶活性降低至83%，3.0μmol/L時其活性降為63.3%，而5.5μmol/L AD能使Na+-K+-ATP酶活性降低至42%。結論 AD對鼻咽癌細胞增殖具有一定的抑制作用，有望成為一種潛在的腫瘤治療藥物。

穿心蓮內(nèi)酯；鼻咽癌細胞；增殖抑制；腫瘤治療藥物

人類鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我國較為常見的頭頸部惡性腫瘤之一。其發(fā)生跟其他腫瘤類似，也是一個多因素、多步驟、多階段的復雜過程，涉及到宿主體內(nèi)的基因型以及表型的變化[1-2]。NPC早期多無明顯臨床癥狀，往往就診時已到中晚期，且大多患者因發(fā)生轉(zhuǎn)移而失去手術的最佳時機。因此，了解NPC的作用機制并尋求有效的抗癌藥物是當務之急。

目前，學者們把抗癌藥物治療策略轉(zhuǎn)向抑制腫瘤侵襲生長過程中的特異性分子和通路的分子靶向治療。在癌癥的發(fā)生中，Na+-K+-ATP酶誘導細胞黏附及信號轉(zhuǎn)導的作用不可忽視，目前認為，其表達及活性與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關，已成為當前抗癌藥物的一個重要靶標。

眾所周知，穿心蓮內(nèi)酯(And rographolide, AD) 是從我國傳統(tǒng)中草藥穿心蓮中提取出來的一類二萜類化合物，常用于消炎解毒等方面的治療，臨床上常用于治療各種感染性疾病[3]。最近研究表明，AD不僅有抗炎作用，而且具有抗腫瘤的潛能[4]。但是有關AD在NPC中的作用尚不清楚。本研究意在探討AD對鼻咽癌細胞增殖有無影響，并從Na+-K+-ATP酶活性方面探討其在NPC中的治療價值。

1 資料和方法

1.1 細胞和主要試劑 鼻咽癌CNE-2細胞由中南大學湘雅醫(yī)學院腫瘤所惠贈；穿心蓮內(nèi)酯（A nd ro）購自Sigm a-A ld rich公司，并用二甲基亞砜溶解使其成為濃度為15mmol/L的貯存液。胎牛血清、RPM I-1640培養(yǎng)基、抗生素均購于美國Invitrogen。其他試劑均購于上海生工。

1.2 細胞培養(yǎng)與處理 人鼻咽癌細胞系CNE-2用含10%胎牛血清的RPM I-1640培養(yǎng)基（pH 7.2）在37℃、5% CO2、飽和濕度條件下進行傳代培養(yǎng)。實驗細胞密度調(diào)整為108/L，分為陰性對照組和AD處理組。其中對照組加入等量的RPM I-1640培養(yǎng)基，處理組加入1.0mm ol/L、3.0mm ol/L、5.5μm ol/L的AD，在37℃下分別處理細胞24h、48h、72h。

1.3 CCK-8檢測鼻咽癌細胞增殖實驗 取長勢良好的CNE-2細胞，調(diào)整細胞濃度為5×104/m L后接種于96孔板中（每孔100uL），每組設立5個復孔，孵育24h。待細胞貼壁后，加入不同濃度的AD孵育24～72h。細胞處理結束后，加入10μL CCK-8溶液（注意避免產(chǎn)生氣泡），37℃繼續(xù)培養(yǎng)1～4h。用酶標儀測定其在450nm處的吸光度。細胞抑制率為：空白組OD值-處理組OD值/空白組OD值×100%。

1.4 FCM法檢測CNE-2細胞周期 采用AD處理過的CNE-2細胞（約1×106個），實驗組和對照組均加入75%的乙醇1.5m L，4℃固定過夜。上機前處理：將固定后的CNE-2細胞用低溫離心機離心，條件為1000rpm 5m in，丟棄上清，再用PBS洗滌2～3次。最后用200μL的預冷的PBS重懸浮CNE-2細胞，最后加入PI染液0.5m L并避光染色30m in。染色完后用200目尼龍網(wǎng)過濾，用FCM檢測細胞核中PI熒光強度，檢測條件：波長為488nm，變異系數(shù)<2%，并通過專業(yè)軟件確定不同時間點的細胞比例。

1.5 Na+-K+-ATP酶活性分析 通過測定酶促反應釋放的無機磷（Pi）的含量多少來確定ATP酶的活性改變情況。其反應體系包括20mm ol/L KC l、100mmol/L NaC l、30mm ol/L T ris-HC l緩沖液（pH 7.4）、2mmol/L ATP以及新鮮細胞線粒體分離物。反應體系加入ATP后，30℃孵育15m in，接著加入15%三氯乙酸終止反應。通過測量640nm處的吸光度分析釋放的無機磷的含量。ATP酶活性的定義為1m g蛋白質(zhì)1h內(nèi)催化ATP生成1μmol/L 無機磷的量為1個單位ATP酶活性。

1.6 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行處理，以上實驗所得到的計量資料數(shù)據(jù)均用（）表示，重復3次，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 AD對CNE-2細胞增殖影響 本研究采用CCK-8法檢測AD對CNE-2細胞的體外生長呈時間-劑量依賴性。從表1可以看出，濃度分別為0、1mm ol/L.0、3.0mm ol/L、5.5μm ol/L的AD體外能顯著抑制CNE-2細胞。不同濃度AD在同一的時間點對CNE-2抑制率劑量增加而遞增。而同一藥物濃度隨作用時間的延長其抑制率也明顯增強。經(jīng)統(tǒng)計學分析，差異顯著（P<0.05）。

2.2 AD對CNE-2細胞周期的影響 0、1.0mm o l/L、3.0mmol/L、5.5μmol/L的AD作用CNE-2細胞72h后，AD處理組相對于對照組，不同濃度的AD能使CNE-2細胞的G0/G1期細胞比例隨AD濃度增加而減少（P<0.05），而S期細胞和G2/M期比例增高反而升高（P<0.05），詳見表2。

2.3 不同濃度AD對Na+-K+-ATP酶活性的影響 不同濃度的AD能不同程度抑制CNE-2細胞Na+-K+-ATP酶活性。其中AD濃度為1.0μmol/L時，能使酶活性降低至83%，3.0μmol/L時其活性為63.3%，而5.5μmol/L AD能使Na+-K+-ATP酶活性降低至42%，見圖3所示。

表1 不同濃度AD在不同作用時間下對CNE-2細胞增值的抑制率

表2 不同濃度AD作用CNE-2細胞72h后對其細胞周期影響分布

圖3 不同濃度AD對CNE-2細胞Na+-K+-ATP酶活性的影響aP<0.05 VS 對照組

3 討論

鼻咽癌患者發(fā)病早期通常選擇放射治療，但總體效果欠佳，原因是不僅鼻咽癌的復發(fā)率較高，且患者就診時大多已經(jīng)到了中晚期。為了選擇更為有效的治療方法，人們堅持不懈地嘗試各種方法，包括基因治療、免疫治療以及化療等[5-7]。但現(xiàn)有的治療手段以及抗癌藥物仍然得不到比較滿意的結果，因此尋求新的藥物是當務之急。

本研究中，我們的研究證實AD能顯著抑制鼻咽癌CNE-2細胞的生長，呈劑量和時間依賴性及使其阻滯于細胞生長周期的S期和G2/M期，并能有效地降低Na+-K+-ATP酶活性。這些研究結果表明AD可能是一種有效延緩鼻咽癌進展的潛在性藥物，其作用機制可能是降低Na+-K+-ATP酶活性，減少細胞間黏附及信號轉(zhuǎn)導實現(xiàn)的。Na+-K+-ATP酶為三羧酸循環(huán)的關鍵酶，由兩個亞單位組成，即1個α-亞單位和1個β亞單位組成的異源二聚體。其中α-亞單位是一種跨膜蛋白，可促進細胞外K+和細胞內(nèi)Na+之間交換[8-9]，所以該酶可調(diào)節(jié)體內(nèi)外離子間的動態(tài)平衡。一般認為引起Na+-K+-ATP酶活性發(fā)生改變各種因素，均可引起線粒體跨膜勢能的改變，因而導致細胞凋亡及釋放凋亡相關分子[10-11]。在本研究中，AD的確能引起Na+-K+-ATP酶活性降低，表明AD引起鼻咽癌細胞中Na+-K+-ATP酶的α-亞單位功能發(fā)生了改變或破壞了線粒體膜的功能，表明線粒體功能障礙可能是AD誘導鼻咽癌細胞凋亡的最終結局[12]。

綜上所述，AD能顯著抑制CNE-2細胞的增殖并能降低Na+-K+-ATP酶活性，從而引起CNE-2細胞凋亡。這表明AD可能是一種潛在的抗癌藥物。但作為一種新的抗癌治療藥物，對鼻咽癌細胞種類以及癌癥的分期的不同可能療效不同，并且其在體內(nèi)研究的有效性及安全性尚需進一步研究。

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10.3969/j.issn.1009-4393.2012.26.017

421001 南華大學腫瘤研究所 （王柏琦 程愛蘭） 421001南華大學附屬第二醫(yī)院腫瘤內(nèi)科（王柏琦）