紅花注射液溶血與凝聚試驗(yàn)的探討

韓文蓮 宋金玲

湖北省襄陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)所，湖北襄陽(yáng) 441021

紅花注射液為活血化瘀、消腫止痛藥，主要用于治療閉塞性腦血管疾病、冠心病、心肌梗死、脈管炎；對(duì)高脂血癥、糖尿病并發(fā)癥、月經(jīng)不調(diào)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等有輔助治療作用。臨床多采用靜脈滴注的方法給藥。文獻(xiàn)規(guī)定[1]：某些中藥注射劑，由于含有溶血成分或物理、化學(xué)及生物等方面的原因，在直接注入血管后可產(chǎn)生溶血作用；也有些注射劑中因含有雜質(zhì)等成分，注入血管后可產(chǎn)生血細(xì)胞凝聚，引起血液循環(huán)功能障礙等不良反應(yīng)；另外，因中藥制劑的成分復(fù)雜，也存在因免疫反應(yīng)引起的免疫性溶血。因此凡是注射劑和可能引起免疫性溶血和非免疫性溶血反應(yīng)的其他藥物制劑均應(yīng)進(jìn)行溶血性試驗(yàn)。紅花注射液雖已在臨床應(yīng)用，但其原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中未設(shè)立溶血與凝聚檢查項(xiàng)。本文通過(guò)對(duì)中藥紅花注射液溶血和凝聚試驗(yàn)的研究，為臨床用藥安全提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試藥與儀器

紅花注射液（規(guī)格：5 mL/支，十堰金鼎制藥有限公司，批號(hào)：110401），80-1離心機(jī)（上海手術(shù)器械廠），紫外分光光度計(jì)UV-2012PC（尤尼柯上海儀器有限公司）。

1.2 動(dòng)物

大耳白兔，體重3.0 kg供采血（湖北襄陽(yáng)動(dòng)物養(yǎng)殖中心）。

2 方法

2.1 2%紅細(xì)胞混懸液的制備

家兔耳緣靜脈取血，放入有玻璃珠和抗凝劑的三角瓶中振搖10 min除去纖維蛋白原，使成脫纖血液，加入0.9%氯化鈉溶液約10倍量，搖勻，于離心機(jī)中1 500 r/min離心10 min，除去上清液，沉淀的紅細(xì)胞再用0.9%氯化鈉溶液按上述方法洗滌3次，至上清液不顯紅色為止[2]。將所得紅細(xì)胞用0.9%氯化鈉溶液配成2%的混懸液，備用，并于當(dāng)天使用。

2.2 溶液制備

取紅花注射液 0.1、0.3、0.5、0.8、1.1 mL，加到試管中平行做3只管，加入無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液補(bǔ)充總體積至2.5 mL，再依次加入2%的紅細(xì)胞混懸液2.5 mL作為供試品管[3]。陰性對(duì)照管加入無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液2.5 mL和2%的紅細(xì)胞混懸液，陽(yáng)性對(duì)照管加入蒸餾水2.5 mL和2%的紅細(xì)胞混懸液，再取4.7 mL 0.9%氯化鈉溶液加0.3 mL的供試品作為供試品的對(duì)照管[1，4]。

2.3 肉眼觀察

將試管放入（37±0.1）℃恒溫箱中進(jìn)行保溫，開(kāi)始每15分鐘觀察1次，1 h后，每隔1 h觀察1次，3 h后取出試管，對(duì)陽(yáng)性對(duì)照管、陰性對(duì)照管、每組供試品管及其供試品對(duì)照管進(jìn)行肉眼觀察。試管中的溶液呈澄明紅色，管底無(wú)細(xì)胞殘留或有少量紅細(xì)胞殘留，表明有溶血發(fā)生；如紅細(xì)胞全部下沉，上清液無(wú)色澄明，或上清液雖有色澄明，各管肉眼觀察無(wú)明顯差異，則表明無(wú)溶血發(fā)生。若溶液中有棕紅色或棕紅色絮狀沉淀，輕輕振搖仍不能分散，則表明有紅細(xì)胞凝聚發(fā)生，應(yīng)進(jìn)一步置顯微鏡下觀察[4]。

2.4 分光光度法

根據(jù)紅細(xì)胞破裂釋放出的血紅素在575 nm波長(zhǎng)處有最大吸收[5]，取各管的上清液置于比色管中，來(lái)測(cè)定紅花注射液的溶血度。將在（37±0.1）℃恒溫1 h后的各管取出，在1 500 r/min離心5 min，上清液取于比色管中，以陰性管作為空白，在575 nm處測(cè)得各管的吸光度[6]。

溶血度（%）=（A試驗(yàn)管-A陰性管）/（A陽(yáng)性管-A陰性管）×100%。式中：A試驗(yàn)管為試驗(yàn)管吸光度，A陰性管為陰性對(duì)照管吸光度，A陽(yáng)性管為陽(yáng)性對(duì)照管吸光度。

3 結(jié)果

3.1 肉眼觀察法測(cè)紅花注射液溶血結(jié)果

通過(guò)與陰性對(duì)照管、陽(yáng)性對(duì)照管、樣品對(duì)照管各管之間的比較后，各管之間肉眼觀察區(qū)別不大。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 肉眼觀察法測(cè)紅花注射液溶血結(jié)果

由表1可見(jiàn)，蒸餾水對(duì)照管（陽(yáng)性對(duì)照管）因體系不等滲而致紅細(xì)胞破裂發(fā)生溶血，形成紅色澄明溶液，0.9%氯化鈉溶液對(duì)照管（陰性對(duì)照管）與各被試管在觀察的時(shí)間內(nèi)均無(wú)溶血及紅細(xì)胞凝集發(fā)生[7]。

3.2 分光光度法溶血測(cè)定結(jié)果

對(duì)本批紅花注射液的溶血度用分光光度法測(cè)定的結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 分光光度法溶血測(cè)定結(jié)果

4 討論

《中國(guó)藥典》[4]規(guī)定了采用肉眼觀察法對(duì)中藥注射液溶血進(jìn)行觀察，適用于溶血較明顯的樣品，但有些中藥注射液本身的顏色和部分紅細(xì)胞破裂后釋放出的血紅色素，對(duì)結(jié)果判斷會(huì)產(chǎn)生影響。

《藥物研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[1]中指出溶血反應(yīng)發(fā)生的機(jī)制復(fù)雜，目前尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn)的臨床前體內(nèi)試驗(yàn)以全面評(píng)價(jià)藥物制劑的溶血反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)注意觀察溶血反應(yīng)的有關(guān)指標(biāo)及體征，如出現(xiàn)溶血時(shí)應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步研究。還對(duì)分光光度法測(cè)定溶血試驗(yàn)的參考指標(biāo)明確指出，當(dāng)溶血率＞5%時(shí)，不宜用于靜脈注射。根據(jù)紅細(xì)胞破裂釋放的血紅素在575 nm有最大吸收的原理[5]，利用分光光度法進(jìn)行溶血性試驗(yàn)操作時(shí)，應(yīng)注意離心的速度及溫度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響?？赡苡行┧幬锓肿蛹案郊觿┰陔x心時(shí)與紅細(xì)胞發(fā)生碰撞的力量較大，若離心速度較快，易導(dǎo)致非藥物溶血現(xiàn)象的出現(xiàn)。此外，因不同的中藥注射劑顏色及深淺不同，若其色澤對(duì)血紅素的最大吸收有干擾，則應(yīng)注意排除非藥物因素的影響[8]。因本品紅花注射液為棕黃色的液體，特設(shè)一底色組，用樣品的吸光度減去底色組的吸光度的差值，提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度。在本實(shí)驗(yàn)中，紅花注射液在恒溫 （37±0.1）℃溫育1 h后肉眼觀察無(wú)明顯溶血現(xiàn)象，在1 500 r/min離心5 min，取上清液于比色皿中，紫外分光光度法檢測(cè)溶血度均小于5%，因此從溶血標(biāo)準(zhǔn)上認(rèn)為本品可以作為靜脈注射用。通過(guò)兩種方法的比較認(rèn)為采用分光光度法測(cè)定中藥注射劑的溶血程度，具有操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好、能消除常規(guī)試管觀察法帶來(lái)的主觀誤差等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)臨床安全用藥有重要的指導(dǎo)意義。

[1]國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局.藥物研究技術(shù)指導(dǎo)原則（中藥·天然藥物刺激性和溶血性研究的技術(shù)指導(dǎo)原則）[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2005：230.

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