維康醇對(duì)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶活性的影響

歷文，尹曉慧，段麗麗，陳杰鵬，周雪瑩，朱曉琳，牛哲峰，張美俠

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院臨床藥理教研室，沈陽 110001；2.齊魯制藥有限公司研發(fā)部，濟(jì)南 250100；3.廣東汕頭保稅區(qū)雙駿生物科技有限公司應(yīng)用生物技術(shù)研究所，廣東 汕頭 515071）

紫杉烷類的代表藥物紫杉醇（paclitaxel，PTX）是從紫杉樹樹皮中提取的一種天然植物類抗腫瘤藥物。研究證實(shí)，PTX是乳腺癌、卵巢癌及非小細(xì)胞肺癌的一線和二線治療藥物，并可用于治療頭頸癌、食管癌、精原細(xì)胞瘤和復(fù)發(fā)性非霍奇金淋巴瘤等［1～5］。維康醇是利用高產(chǎn)PTX菌種發(fā)酵生產(chǎn)的新型單體化合物，本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果證實(shí)：維康醇對(duì)肝癌、胰腺癌、卵巢癌等多種腫瘤細(xì)胞株具有增殖抑制作用，可引起細(xì)胞周期阻滯并誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和凋亡，但其具體的作用靶點(diǎn)尚不清楚。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶（topoisomerase）參與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組及修復(fù)等所有關(guān)鍵的細(xì)胞核內(nèi)過程，是抗腫瘤研究的熱點(diǎn)。本研究擬探討維康醇對(duì)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

pBR322 DNA（產(chǎn)品號(hào)：D3050）、DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶 Ⅰ（TopoⅠ）（產(chǎn)品號(hào)：D2240A）、ATP、（產(chǎn)品號(hào)：D4041）購自TaKaRa公司；DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα（TopoⅡα）（產(chǎn)品號(hào)：T8944-100UN） 購自 Sigma公司；10-羥基喜樹堿 （10-hydroxy camptothecin，10-HCPT）由沈陽藥科大學(xué)提供；依托泊苷（產(chǎn)品號(hào)：105007HN）購自山東齊魯藥業(yè)有限公司；溴化乙錠（ethidium bromide，EB）購自 Amresco公司；維康醇由廣東汕頭保稅區(qū)雙駿生物科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 TopoⅠ介導(dǎo)的解旋作用及藥物的影響：反應(yīng)體系：pBR322 DNA 0.5 μg，DNA TopoⅠbuffer 2 μL，DNA TopoⅠ1 U（1 U定義為在37℃、30 min內(nèi)把0.5 μg/50 μL 的 supercoiled pBR322 DNA 轉(zhuǎn)換成100%的松散型酶的活性），0.1%BSA 2 μL，不同濃度（1，5，50 mmol/L）維康醇溶液 2 μL（實(shí)驗(yàn)組）或不同濃度（5，50 mmol/L）10-HCPT 2 μL（陽性對(duì)照組），滅菌蒸餾水補(bǔ)足至20 μL。37℃反應(yīng)30 min，加入5 μL的5×反應(yīng)終止液（0.74%EDTA，50%丙三醇，0.1%溴酚藍(lán)顯色液）終止反應(yīng)。在TAE緩沖液中行0.8%瓊脂糖凝膠電泳40 min（電壓50 V）。電泳結(jié)束后 EB（0.5 μg/mL）染色 30 min，應(yīng)用 Tanon Gls凝膠圖像分析系統(tǒng)軟件在紫外燈下對(duì)電泳凝膠圖像進(jìn)行觀察并拍照分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 瓊脂糖凝膠電泳法測(cè)定TopoⅡ的活性及藥物的影響：10×反應(yīng)緩沖液（pH8.0 0.5 mol/L Tris-HCl，1.2 mol/L KCl，5 mmol/L DTT，0.1 mol/L MgCl2，5 mmol/L ATP） 2 μL，50 μg/mL BSA 1 μL，pBR322 DNA 0.5 μg，DNA TopoⅡ2 U，及不同濃度的維康醇溶液 2 μL（實(shí)驗(yàn)組）或依托泊苷溶液 2 μL（陽性對(duì)照組），滅菌蒸餾水補(bǔ)足至 20 μL。37℃反應(yīng)30 min，加入5 μL的5×反應(yīng)終止液終止反應(yīng)，在TAE緩沖液中行0.8%瓊脂糖凝膠電泳40 min（電壓50 V）。電泳結(jié)束后 EB（0.5 μg/mL）染色 30 min，應(yīng)用 Tanon Gls凝膠圖像分析系統(tǒng)軟件在紫外燈下觀察電泳凝膠圖像并拍照分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 維康醇對(duì)TopoⅠ介導(dǎo)的解旋作用的影響

TopoⅠ切斷DNA雙鏈中的1股，使DNA雙鏈在解鏈旋轉(zhuǎn)中不致打結(jié)，適當(dāng)時(shí)候再把切口封閉，使DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)，從而可催化超螺旋的DNA松弛解旋。利用TopoⅠ介導(dǎo)的負(fù)超螺旋pBR322 DNA解旋作用，觀察維康醇對(duì)TopoⅠ活性的影響。結(jié)果如圖 1所示：超螺旋 DNA（pBR322 DNA，lane D）在TopoⅠ作用下解旋呈松散型DNA（lane T），隨著陽性對(duì)照藥物10-HCPT濃度的升高，抑制了TopoⅠ介導(dǎo)的對(duì)pBR322 DNA的解旋作用（lane E），不同濃度的維康醇對(duì)TopoⅠ介導(dǎo)的pBR322 DNA解旋無明顯影響（lane Alternol）。

2.2 維康醇對(duì)TopoⅡ介導(dǎo)的解旋作用的影響

如圖2所示：超螺旋DNA（pBR322 DNA，lane D）在TopoⅡ作用下解旋呈松散型DNA（lane T），不同濃度的陽性對(duì)照藥物依托泊苷均對(duì)TopoⅡ介導(dǎo)的pBR322 DNA解旋有抑制作用（lane E），不同濃度的維康醇對(duì)TopoⅡ介導(dǎo)的pBR322 DNA解旋有明顯抑制作用，在濃度達(dá)到5 μmol/L時(shí)抑制作用與依托泊苷5 μmol/L時(shí)的抑制作用相近（lane Alternol）。

3 討論

DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶是廣泛存在于真核和原核生物體內(nèi)的基本酶之一，參與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組及修復(fù)等所有關(guān)鍵的細(xì)胞核內(nèi)過程，在細(xì)胞生命過程中起重要作用。TopoⅠ通過調(diào)節(jié)超螺旋、連鎖、去連鎖以及核酸解結(jié)作用，影響DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)［6］；TopoⅡ在腫瘤細(xì)胞中的含量及活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常細(xì)胞，通過調(diào)節(jié)核酸結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化，在DNA復(fù)制完成后使相互交聯(lián)的姐妹染色體分開，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及防治等有密切關(guān)系。由于DNA超螺旋程度影響著機(jī)體的活動(dòng)，而拓?fù)洚悩?gòu)酶的作用正是控制DNA的空間構(gòu)型酶，因此，該酶被列為篩選抗腫瘤藥物的重要靶酶［7～9］。

從天然藥物中篩選高效低毒的抗腫瘤藥物是獲取抗腫瘤藥物的重要策略。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究結(jié)果表明：維康醇有抑制肝癌細(xì)胞增殖、引起細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和凋亡的作用。本研究以DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶為靶點(diǎn)探討維康醇對(duì)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶活性的影響，分別采用1 U TopoⅠ和2 U TopoⅡ的反應(yīng)體系進(jìn)行研究（經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明，1 U TopoⅡ的反應(yīng)體系對(duì)DNA的解旋作用效果并不明顯，因此選用2 U TopoⅡ的反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)）。本研究結(jié)果表明：維康醇能明顯抑制TopoⅡ的活性，抑制其介導(dǎo)的DNA解旋或斷裂，但對(duì)TopoⅠ的活性幾乎無影響，因此我們推測(cè)維康醇對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用可能與其抑制TopoⅡ的活性有關(guān)，TopoⅡ可能是其抗腫瘤作用的細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)之一，且維康醇對(duì)TopoⅡ的抑制作用與同濃度陽性對(duì)照藥依托泊苷相似，未來有可能成為TopoⅡ抑制劑依托泊苷的代替品。因此，維康醇是值得關(guān)注的抗腫瘤藥物。拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑按藥物作用方式可分為拓?fù)洚悩?gòu)酶毒劑和拓?fù)洚悩?gòu)酶阻遏劑；按藥物與DNA的結(jié)合方式可分為DNA嵌入劑和DNA非嵌入劑。關(guān)于維康醇具體屬于哪一種拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑仍有待進(jìn)一步研究確認(rèn)［10，11］。

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