應(yīng)用組織芯片技術(shù)檢測(cè)結(jié)直腸癌組織中KAI1/CD82和ME491/CD63的表達(dá)

季潤(rùn)元，史恩溢，王永實(shí)，李小寧，趙玉芳，馮振卿

（1.江蘇省淮陰衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校，淮安市消化道腫瘤重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 淮安 223300；2.江蘇省蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院病理教研室，江蘇 蘇州 215009；3.江蘇省淮安市腫瘤醫(yī)院病理科，江蘇 淮安 223200；4.南京醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)系，南京 210029）

跨膜4超家族（transmembrane 4 superfamily，TM4SF）是結(jié)構(gòu)上屬于細(xì)胞膜糖蛋白的特殊家族，該家族中有 5個(gè)成員即 MRP1/CD9、ME491/CD63、KAI1/CD82、CD151和CD81，與細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、增殖和腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有關(guān)［1］。KAI1（kang ai 1）基因是美籍華人DONG于1995年發(fā)現(xiàn)的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因［2］，KAI1基因?qū)^大多數(shù)腫瘤的轉(zhuǎn)移起抑制作用，與腫瘤的侵襲力、預(yù)后明顯相關(guān)。KAI1編碼區(qū)編碼267個(gè)氨基酸殘基、分子量為29.6 kDa的蛋白質(zhì)，與已發(fā)現(xiàn)的CD82結(jié)構(gòu)相同。CD82是一種白細(xì)胞表面糖蛋白，屬于跨膜4超家族（TM4SF）成員［3］。黑色素瘤相關(guān)抗原ME491（melanoma associated antigen ME491）在腫瘤早期進(jìn)展過程中高度表達(dá)。CD63最初報(bào)道與血小板激活有關(guān)，是一種溶酶體糖蛋白，存在于多種類型細(xì)胞表面，研究最多的是在人黑色素瘤細(xì)胞中的表達(dá)。序列分析發(fā)現(xiàn)ME491和CD63是相同的。KAI1/CD82、ME491/CD63屬于跨膜4超家族（TM4SF）成員，目前認(rèn)為與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)［4］。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集江蘇省淮安市腫瘤醫(yī)院2005-2010年結(jié)直腸癌手術(shù)切除標(biāo)本232例，男性119例（51.3%），女性113例（48.7%）。結(jié)直腸癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)按WHO腸道腫瘤組織學(xué)分型進(jìn)行，所有樣本切片均經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)。病理分型均為腺癌，其中高分化34例，中分化154例，低分化44例。Dukes分期：A期10例、B期127例、C期73例、D期22例。所有患者均無腸癌家族遺傳史，術(shù)前均未接受過放化療。

1.2 組織芯片構(gòu)建

所有病例的腫瘤組織標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。依據(jù)HE切片確定具有代表性的病變部位，應(yīng)用自有專利技術(shù)（專利號(hào)200920350099.2）組織芯片構(gòu)建儀制備組織芯片。主要步驟如下：用構(gòu)建儀在選取的組織蠟塊中穿取組織，直徑1.5 mm。應(yīng)用自有的組織芯片制備系統(tǒng)（包括組織芯片包埋底模、組織芯片膠、組織芯片陣列模、一次性加取樣針及其配套使用的針芯和針帽、定位冷卻器以及植芯器等組成部分）依次按序操作，成功制成含有232例結(jié)直腸癌的組織芯片蠟塊，每個(gè)病例均含有2個(gè)原發(fā)灶腫瘤組織。用德國(guó)LEICA石蠟切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)切片，厚度為4 μm。

1.2 主要試劑

鼠抗人KAI1/CD82購自美國(guó)Santa Cruz公司，鼠抗人ME491/CD63單克隆抗體購自美國(guó)Thermo公司，MaxVision試劑盒、DAB酶底物顯色試劑盒等試劑購自福州邁新公司。

1.3 方法

KAI1/CD82和ME491/CD63染色方法為MaxVison兩步法，嚴(yán)格按照MaxVision染色試劑盒中說明書進(jìn)行操作。KAI1/CD82和ME491/CD63工作濃度為1∶50。結(jié)直腸癌組織芯片常規(guī)脫蠟水化，加一抗之前1 mmol/L EDTA（pH 8.0）水浴修復(fù)20 min。而后加一抗4℃冰箱過夜，第2天切片恢復(fù)室溫后，加MaxVision二抗溫箱培育30 min，DAB顯色，蘇木精襯染。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含棕褐色顆粒者為KAI1/CD82和ME491/CD63陽性細(xì)胞。按陽性細(xì)胞占鏡下腫瘤細(xì)胞的百分比將陽性強(qiáng)度分為4個(gè)等級(jí)，分別是無陽性細(xì)胞為（-），陽性細(xì)胞占<25%為（+），25%～50%為（++），>50%為（+++），（-）～（+）記為陰性，（++）～（+++）記為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

將所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)輸入SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包，KAI1/CD82和ME491/CD63表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理因素之間的相互關(guān)系應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，KAI1/CD82和ME491/CD63表達(dá)之間的相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman相關(guān)分析。以α=0.05作為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織芯片

464個(gè)組織點(diǎn)陣排列整齊，HE、免疫組化染色均勻，無掉片、脫片、扭曲和重疊現(xiàn)象。

2.2 KAI1/CD82和ME491/CD63在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)情況

KAI1/CD82和ME491/CD63免疫組化陽性反應(yīng)產(chǎn)物均主要定位于細(xì)胞質(zhì)和（或）細(xì)胞膜（圖1，圖2）。KAI1/CD82陽性者117例，陰性者115例，陽性表達(dá)率為50.4%。ME491/CD63陽性者204例，陰性者28例，陽性表達(dá)率為87.9%。

2.3 KAI1/CD82和ME491/CD63表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

KAI1/CD82的表達(dá)與結(jié)直腸癌的分化程度和Dukes分期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，KAI1/CD82在中-高分化、Dukes A+B+C期結(jié)直腸癌的陽性表達(dá)率顯著高于低分化、Dukes D期結(jié)直腸癌（53.7%vs 36.4%，P＜0.05；52.9%vs 27.3%，P＜0.05，表 1），而與患者的性別、年齡及癌組織浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表1）；ME491/CD63的表達(dá)與患者的性別、年齡及癌組織浸潤(rùn)深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Dukes分期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表 1）。

表1 KAI1/CD82和ME491/CD63表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Relationships between the expression ofKAI1/CD82，ME491/CD63 and their clinicopathological characteristic in colorectal carcinoma

2.4 MRP1/CD9和ME491/CD63在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)關(guān)系

本研究對(duì)KAI1/CD82和ME491/CD63的表達(dá)進(jìn)行Spearman相關(guān)分析。結(jié)果表明，232例結(jié)直腸癌組織標(biāo)本中，KAI1/CD82和ME491/CD63在結(jié)直腸癌中的表達(dá)呈顯著正相關(guān)（r=0.136，P＜0.05）。

3 討論

KAI1/CD82在其抑制腫瘤轉(zhuǎn)移作用發(fā)現(xiàn)之前，是作為一種白細(xì)胞膜糖蛋白被認(rèn)識(shí)的。Dong等［2］將KAI1cDNA轉(zhuǎn)染高轉(zhuǎn)移的鼠黑色素瘤細(xì)胞系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)表達(dá)KAI1的克隆吞噬能力及侵襲能力均下降，而且這些改變均呈劑量效應(yīng)關(guān)系。表達(dá)KAI1的克隆細(xì)胞在裸鼠肺內(nèi)形成的轉(zhuǎn)移克隆數(shù)也較親代明顯減少。這些都說明KAI1/CD82具有直接的抑制腫瘤轉(zhuǎn)移作用。KAI1/CD82的表達(dá)缺失或下調(diào)已經(jīng)在多種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)，如肺癌［3］、胃癌［4］、胰腺癌［5］、乳腺癌［6］、膀胱癌［7］等。本研究發(fā)現(xiàn)，KAI1/CD82 在低分化結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)顯著低于高分化癌組織，且Dukes D期癌組織中KAI1/CD82的表達(dá)低于Dukes A、B、C期癌組織。說明分化越差、惡性程度越高的結(jié)直腸癌細(xì)胞，KAI1/CD82蛋白表達(dá)缺失的越多。

本研究顯示結(jié)直腸癌中KAI1/CD82的表達(dá)與患者的性別、年齡、腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)（P>0.05）。其中，研究結(jié)果所顯示的結(jié)直腸癌中KAI1/CD82的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，這不同于國(guó)內(nèi)外絕大部分研究的結(jié)論。目前國(guó)內(nèi)外的研究均認(rèn)為KAI1/CD82是腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制基因，腫瘤發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)表達(dá)下調(diào)。作者以前在食管癌［8］和胃癌［9］中的研究，也認(rèn)為KAI1是腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制基因。本研究嘗試用KAI1/CD82表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)不同百分比作為分組標(biāo)準(zhǔn)，均得出相同的結(jié)論，KAI1/CD82的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。Dukes A、B和Dukes C、D比較同樣沒有顯著性差別。但Dukes D期癌組織中KAI1/CD82的表達(dá)低于Dukes A、B、C期癌組織，我們可以認(rèn)為，當(dāng)結(jié)直腸癌進(jìn)展到Dukes D期才出現(xiàn)KAI1/CD82的表達(dá)下調(diào)。在樣本數(shù)量較大、實(shí)驗(yàn)判斷精確的情況下，為什么會(huì)得出這樣與其他實(shí)驗(yàn)不同的結(jié)論，值得進(jìn)一步探討。

黑色素瘤相關(guān)抗原ME491（melanoma associated antigen ME491）在腫瘤早期進(jìn)展過程中高度表達(dá)。以人重復(fù)Alu序列為探針從λ基因文庫篩選、通過DNA介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方法克隆出ME491基因。ME491抗原由237個(gè)氨基酸組成，有4個(gè)跨膜區(qū)，3個(gè)N-糖基化點(diǎn)［11］。關(guān)于ME491/CD63研究最多的是在人黑色素瘤細(xì)胞中的表達(dá)。ME491/CD63在黑色素瘤早期階段表現(xiàn)為高表達(dá)，但在正常黑色素細(xì)胞中不表達(dá)，在黑色素瘤進(jìn)展階段和轉(zhuǎn)移性黑色素瘤中低表達(dá)或不表達(dá)。ME491/CD63的表達(dá)與其他惡性腫瘤關(guān)系的研究，目前已見報(bào)道的有乳腺癌、非小細(xì)胞性肺癌、角質(zhì)上皮癌、胰腺癌［11］，上述惡性腫瘤均表達(dá)ME491/CD63，但未發(fā)現(xiàn)ME491/CD63的表達(dá)與腫瘤的分級(jí)、轉(zhuǎn)移、預(yù)后有關(guān)。也有研究認(rèn)為ME491/CD63表達(dá)與腫瘤進(jìn)展有關(guān)［4］。在本研究中，未能證明ME491/CD63表達(dá)與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移、分級(jí)、浸潤(rùn)深度、Dukes分期有相關(guān)性（P＞0.05）。

本研究的結(jié)果亦顯示KAI1/CD82和ME491/CD63的表達(dá)呈顯著相關(guān)性，未見文獻(xiàn)報(bào)道。對(duì)KAI1/CD82和ME491/CD63及他們與腫瘤相關(guān)性的深入研究，將有助于我們進(jìn)一步揭示腫瘤的轉(zhuǎn)移機(jī)制，找到抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的靶點(diǎn)或預(yù)測(cè)腫瘤患者預(yù)后的指標(biāo)。

［1］Lanza F，Wolf D，F(xiàn)ox CF，et al.cDNA cloning and expression of platelet P24/MRP1/CD9，evidence for a new family of multiple membrane-spanning proteins［J］.J Biol Chem，1991，266（16），10638-10645.

［2］Dong JT，Lamb PW，Rinker CW，et al.KAI1，a metastasis suppressor gene for prostate cancer on human chromosome 11p11.2［J］.Scinece，1995，268（5212）：884-886.

［3］Malik FA，Sanders AJ，Jiang WG，et al.KAI-1/CD82，the molecule and clinical implication in cancer and cancer metastasis［J］.Histol Histopathol，2009，24（4）：519-530.

［4］Chen Z，Gu S，Trojanowicz B，et al.Down-regulation of TM4SF is associated with the metastatic potential of gastric carcinoma TM4SF members in gastric carcinoma［J］.World J Surg Oncol，2011，27（9）：43.

［5］Xu JH，Guo XZ，Ren LN，et al.KAI1 is a potential target for antimetastasisinpancreaticcancercells［J］.World J Gastroenterol，2008，14（7）：1126-1132.

［6］Malik FA，Sanders AJ，Jones AD，et al.Transcriptional and translational modulation of KAI1 expression in ductal carcinoma of the breast and the prognostic significance［J］.Int J Mol Med，2009，23（2）：273-278.

［7］Jackson P，Rowe A，Grimm MO，et al.An alternatively spliced KAI1 mRNA is expressed at low levels in human bladder cancers and bladder cancer cell lines and is not associated with invasive behaviour［J］.J Oncol Rep，2007，18（6）：1357-1363.

［8］季潤(rùn)元，束曉明，張徐寧，等.食管癌組織KAI1/CD82、MRP1/CD9的表達(dá)及其病理臨床聯(lián)系［J］.江蘇醫(yī)藥，2010，36（13）：1498-1501.

［9］趙玉芳，季潤(rùn)元，束曉明，等.胃癌KAI1/CD82、Ki67的表達(dá)與其臨床病理特征的關(guān)系［J］.江蘇醫(yī)藥，2011，37（18）：2192-2193.

［10］Chirumbolo S.Monitoring of CD63 in basophil activation test and suggested new parameters for allergy diagnosis［J］.Inflamm Res，2012，61（2）：171-176.

［11］Jang HI，Lee H.A decrease in the expression of CD63 tetraspanin protein elevates invasive potential of human melanoma cells［J］.Exp Mol Med，2003，35（4）：317-323.