曲霉菌細(xì)胞工廠的現(xiàn)狀及前景

顧豐穎，高 潔，何國慶

(浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310058)

曲霉菌(Aspergilli)是一類最為常見的真核微生物，被應(yīng)用于傳統(tǒng)的食品發(fā)酵中也具有悠久的歷史。近年來，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，曲霉菌在食品工業(yè)，飼料業(yè)，制藥業(yè)等方面均顯示出重要的應(yīng)用價(jià)值。與細(xì)菌及酵母等相比，曲霉具有強(qiáng)大的降解酶系及完善的蛋白分泌途徑，使其具有可快速生長(zhǎng)繁殖，適應(yīng)惡劣環(huán)境，在低值培養(yǎng)基及低pH環(huán)境中仍能保持較高的生物代謝活性等特性。此外曲霉菌具有高效分泌系統(tǒng)［1-2］，可將酶或其他多肽高效分泌出體外，有利于重組蛋白的分離純化。由于其可更好的適應(yīng)工業(yè)發(fā)酵，曲霉菌逐步被開發(fā)為良好的工業(yè)生產(chǎn)宿主菌即微生物細(xì)胞工廠。目前已被分類并已命名曲霉屬約有250種［3］，其中包括黑曲霉(A.niger)、米曲霉(A.oryzae)、泡盛曲霉(A.awamori)、醬油曲霉(A.sojae)、土曲霉(A.terreus)等許多重要的工業(yè)菌種。近年來通過生物技術(shù)的介入，曲霉菌已被開發(fā)成為多種有機(jī)酸(檸檬酸、沒食子酸、葡糖酸等)以及工業(yè)酶、蛋白制劑(纖維素酶、淀粉酶、果膠酶等)的主要工業(yè)生產(chǎn)菌［4］。

1 曲霉菌基因及基因組

1.1 策略及工具

近十年來隨著對(duì)真菌曲霉研究的深入，更多的新方法及技術(shù)被應(yīng)用在對(duì)曲霉菌的基因研究中，這些研究主要圍繞在以下幾個(gè)方面［5］。第一是建立有效的遺傳轉(zhuǎn)化體系。缺乏有效的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)一度成為曲霉菌株工業(yè)化基因操作最大的障礙，這不僅限制了選擇性標(biāo)記的有效性，還降低了基因打靶效率(通常約1%～5%)。近年來，以原生質(zhì)體介導(dǎo)的多種曲霉(包括黑曲霉，米曲霉，土曲霉，醬油曲霉等)的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)得以建立［6］;泡盛曲霉的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)也通過土壤桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化得到有效的解決［7］。此外，已開發(fā)的自主復(fù)制載體融合了多種選擇性標(biāo)記系統(tǒng)(如抗生素抗性標(biāo)記:hph、ble、oliC3;營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記:pyrG、pyrE、argB、adeA、adeB、niaD、trpC、sC;營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記amdS、ptrA等)，這為曲霉菌株的工業(yè)化基因操控提供了更大的可能性［8-10］。曲霉菌分子研究的大躍進(jìn)基于真菌模式菌株粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)的開發(fā)，對(duì)其研究中發(fā)現(xiàn)當(dāng)受體菌株缺乏非同源末端連接(non-homologous end joining)時(shí)，同源重組率可增加到100%。這已在黑曲霉、米曲霉等多個(gè)曲霉菌種得到證實(shí)。

其次是建立高水平可控的蛋白生產(chǎn)的表達(dá)系統(tǒng)。目前應(yīng)用曲霉菌生產(chǎn)重組蛋白的表達(dá)系統(tǒng)已有多個(gè)成功案例，二十多種曲霉啟動(dòng)子被應(yīng)用于高水平的同源或異源蛋白的生產(chǎn)中［9］。這些啟動(dòng)子一般是通過結(jié)構(gòu)活性(葡糖淀粉酶啟動(dòng)子PglaA等)或培養(yǎng)基碳源的誘導(dǎo)作用(乙醇脫氫酶啟動(dòng)子 PalcA、α-淀粉酶啟動(dòng)子PamyA等)而產(chǎn)生效應(yīng)的。此外建立高通量基因定向工具，以及建立細(xì)胞生物技術(shù)研究的影像播放技術(shù)也是曲霉菌基因研究的主要方向。

1.2 曲霉菌的基因組學(xué)

1998年，Cereon公司對(duì)構(gòu)巢曲霉(A.nidulans FGSC A4)的基因組進(jìn)行測(cè)序從而開啟了曲霉菌基因組測(cè)序的先河，該全基因組采用鳥槍法測(cè)序，3倍覆蓋率，然而該序列的信息在近年來才被公開。隨后，構(gòu)巢曲霉的全基因組進(jìn)一步采用了13倍覆蓋率進(jìn)行測(cè)序，并在2003年被Whitehead機(jī)構(gòu)/MIT基因組研究中心(也就是現(xiàn)在的Broad機(jī)構(gòu))公開，其全基因大小約30.1M堿基對(duì)，包含了8個(gè)染色體組［11］。隨后，真菌特別是曲霉菌的基因組得到快速的發(fā)展(表1)，例如韋爾科姆基金會(huì)桑格研究院(Wellcome Trust Sanger institute)以及基因組研究學(xué)會(huì)(TIGR)共同進(jìn)行的煙曲霉(A.fumigatus Af293)基因組測(cè)序，采用全基因組隨機(jī)測(cè)序方法結(jié)合光學(xué)標(biāo)測(cè)法(optical mapping)獲得包括8個(gè)染色體組的29.4M堿基對(duì)的序列數(shù)據(jù)［12］。而三株不同的黑曲霉工業(yè)菌株的基因組也先后被三家機(jī)構(gòu)測(cè)序(即荷蘭的帝斯曼公司DSM、美國Integrated Genomics公司及美國能源部基因組學(xué)研究所JGI)。2001年底DSM首先采用BAC和鳥槍法完成了黑曲霉CBS 513.88的測(cè)序，大小33.9Mb，8倍覆蓋率14000多個(gè)基因，但該數(shù)據(jù)一直到2007年前一直為其公司內(nèi)部使用［13］。隨后，黑曲霉ATCC 9029菌株被Integrated Genomics公司測(cè)序，大小約32Mb，4倍覆蓋率，約10000個(gè)重疊群。與此同時(shí)在美國能源部的支持下JGI完成了黑曲霉ATCC 1015菌株的基因組測(cè)序，獲得約34.9Mb的序列信息，8.9倍覆蓋率并于2006年公開發(fā)表［14］。此外，對(duì)米曲霉(A.oryzae)的測(cè)序由日本的工業(yè)科學(xué)技術(shù)進(jìn)展國際學(xué)會(huì)(AIST)進(jìn)行。米曲霉RIB40的全基因組于2005年公開發(fā)表，基因組大小約37.2Mb，9倍覆蓋率，包括8個(gè)染色體組［15］。到目前，曲霉菌的基因組測(cè)序已完成了十余個(gè)，表2為已公開發(fā)表的曲霉基因組序列的公共網(wǎng)址。

表1 曲霉菌基因組的簡(jiǎn)要信息Table 1 Summary of information on Aspergillus genomes

曲霉基因組數(shù)據(jù)的公開，使建立在基因組基礎(chǔ)上的轉(zhuǎn)錄組，蛋白質(zhì)組及代謝組等方面的研究得到快速的發(fā)展。所獲得的大量基礎(chǔ)數(shù)據(jù)為建立曲霉菌細(xì)胞工廠奠定了基礎(chǔ)，也為工業(yè)生產(chǎn)菌株的性能改造提供了更多的思路以及更大的可能性。

2 后基因組時(shí)代曲霉菌組學(xué)技術(shù)的發(fā)展

真菌基因組測(cè)序的大規(guī)模完成使曲霉菌的研究進(jìn)入了系統(tǒng)生物學(xué)的時(shí)代。為挖掘探討并更好地利用所獲得的大量數(shù)據(jù)，一些新技術(shù)新方法也應(yīng)運(yùn)而生，從而產(chǎn)生了真菌生物學(xué)研究的一個(gè)全新技術(shù)——組學(xué)技術(shù)(Omics)。對(duì)全基因、全蛋白以及代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)整體的研究取代了過去對(duì)單個(gè)基因單個(gè)蛋白的研究，這使對(duì)曲霉工業(yè)菌株在生產(chǎn)性能，穩(wěn)定性能及可行性上的分析更為深刻。組學(xué)技術(shù)可分支為轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、反應(yīng)組學(xué)及表達(dá)組學(xué)等，這些全新的技術(shù)及方法為構(gòu)建曲霉菌細(xì)胞工廠提供新的思路，并使其得以實(shí)現(xiàn)。

2.1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)(Transcripomics)

利用DNA芯片對(duì)比分析細(xì)胞mRNA，一般分為以已知的DNA序列為基礎(chǔ)的寡核苷酸陣列、cDNA微陣列及EST分析等技術(shù);或?qū)ξ粗蛄行畔⑦M(jìn)行分析的基因表達(dá)系列分析(SAGE)、差異消減雜交(SSH)等技術(shù)。近年來，對(duì)曲霉菌轉(zhuǎn)錄組的研究也取得了一定進(jìn)展。Guillemette、Levin及Jacobs等人提供了一種整合轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)組的方法，從而改善了黑曲霉的蛋白分泌能力［16-18］。Anderson通過基因芯片對(duì)黑曲霉、米曲霉及構(gòu)巢曲霉的比較轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果鑒定得到了曲霉菌中的23個(gè)保守基因及365個(gè)差異表達(dá)蛋白［19］。而DNA微陣列技術(shù)也被應(yīng)用于對(duì)米曲霉的比較轉(zhuǎn)錄組分析中［20］，這種技術(shù)可以有效的對(duì)曲霉菌的代謝產(chǎn)物進(jìn)行鑒別，為工業(yè)新蛋白的開發(fā)利用提供了新的工具。

2.2 蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)

有關(guān)曲霉菌蛋白質(zhì)組學(xué)方面的研究，在近5年逐漸引起人們的關(guān)注，新增了大量基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。大量序列被分析并公布其結(jié)果，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究技術(shù)得到快速的發(fā)展。微生物的蛋白質(zhì)組學(xué)研究目前主要有3種策略:一是表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)，二是比較蛋白質(zhì)組學(xué)，三是免疫蛋白質(zhì)組學(xué)。建立在二維聚丙烯酰胺凝膠電泳和質(zhì)譜的基礎(chǔ)上涌現(xiàn)了大量的新技術(shù)，為準(zhǔn)確而大規(guī)模獲取蛋白質(zhì)組有效數(shù)據(jù)提供了有效的手段。其中包括蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)絕對(duì)定量技術(shù)(protein standard absolute quantification，PSAQ);多連體定量標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(quantitative concatenated standard，QconCAT);蛋白豐度的絕對(duì)定量(absolute quantification of abundance，AQUA);細(xì)胞培養(yǎng)的氨基酸穩(wěn)定同尾數(shù)標(biāo)記技術(shù)(stable isotope labelling by amino acids in cell culture，SILAC);同位素親和標(biāo)簽技術(shù)(isotope-coded affinity tags，ICAT);等量標(biāo)記的相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)(isobaric tag for absolute and relative quantificationi，TRAQ);串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽(tandemmass tags，TMT);同位素蛋白標(biāo)記技術(shù)(isotopecoded protein labelling，ICPL)等。技術(shù)的發(fā)展也使曲霉菌的蛋白質(zhì)組學(xué)研究取得了突飛猛進(jìn)的成果，Teutschbein 等［21］對(duì)煙曲霉(Aspergillus fumigatus)分生孢子的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，推測(cè)分生孢子的復(fù)雜蛋白質(zhì)組成與其應(yīng)激抗性以及快速萌發(fā)有著密切關(guān)系。對(duì)萌發(fā)的煙曲霉分生孢子的研究顯示:CipC-like蛋白是一種菌絲特異性蛋白，這種胞內(nèi)蛋白的生物學(xué)功能尚不明確，推測(cè)其可能與侵襲性生長(zhǎng)相關(guān)。2005 年，Schwienbacher［22］對(duì)煙曲霉的主要分泌蛋白進(jìn)行分析，鑒定確定其分泌組中包含多種代謝相關(guān)酶，如核糖核酸酶(與抑制真核蛋白合成相關(guān))、脫乙酰幾丁質(zhì)酶chiB及β-1，3內(nèi)切葡聚糖酶兩種細(xì)胞壁多聚物降解酶。Adav等應(yīng)用iTRAQ技術(shù)［23］對(duì)不同pH下的黑曲霉分泌蛋白質(zhì)組的分析表明:黑曲霉的蛋白質(zhì)組組成可通過調(diào)節(jié)pH發(fā)生顯著的變化，即一些特定酶的生產(chǎn)可通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH完成。除了對(duì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)組，分泌蛋白質(zhì)組的研究外，對(duì)曲霉的亞蛋白質(zhì)組，細(xì)胞壁及膜蛋白的蛋白質(zhì)組的研究也逐漸成為又一個(gè)新的熱點(diǎn)。

表2 曲霉菌的公共基因組網(wǎng)址Table 2 Public genome websites for different Aspergillus species

2.3 代謝組學(xué)(Metabolomics)

繼基因組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)之后，基于高通量定量分析生物體內(nèi)所用代謝物的思路，代謝組學(xué)得以發(fā)展起來。其主要技術(shù)手段包括核磁共振(NMR)，質(zhì)譜(MS)，色譜(HPLC，GC)以及氣質(zhì)聯(lián)用(GCMS)，液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)和氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(GC-TOF)等。由于代謝物的濃度是直接與代謝途徑相關(guān)的，因此對(duì)曲霉菌代謝組的分析可以有效的指導(dǎo)我們應(yīng)該對(duì)菌株的哪些代謝途徑進(jìn)行改造，為合理構(gòu)建并優(yōu)化曲霉菌細(xì)胞工廠奠定基礎(chǔ)。Kouskoumvekaki［24］等對(duì)重組曲霉菌代謝組學(xué)研究，在對(duì)450種重組菌代謝物的鑒定分析中發(fā)現(xiàn)，其中7種代謝物可以作為生物標(biāo)記用于菌株的基因型鑒定。2008年，基于基因組數(shù)據(jù)庫及擴(kuò)展數(shù)據(jù)，Andersen［25］等和 Vongsangnak［26］等分別建立了黑曲霉及米曲霉的代謝網(wǎng)絡(luò)。而Microbia公司結(jié)合了轉(zhuǎn)錄組學(xué)及代謝組學(xué)的分析，對(duì)土曲霉調(diào)控基因進(jìn)行改造，使其洛伐他汀(lovastatin)的生產(chǎn)力提高了50%，為工業(yè)生產(chǎn)力的提高提供了更大的創(chuàng)造空間［27］。

3 新構(gòu)思及展望

3.1 后基因組時(shí)代的新產(chǎn)品

由于曲霉菌被做為食品工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、酶制劑工業(yè)等多方面領(lǐng)域的細(xì)胞工廠的地位得以肯定，在曲霉菌基因組的研究已獲得了大量數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，對(duì)曲霉菌新一輪的基因組挖掘(genome mining)正如火如荼的進(jìn)行著。事實(shí)上，對(duì)基因組的分析結(jié)果已揭示了比預(yù)期更多的次級(jí)代謝生物合成過程。典型的曲霉菌基因一般存在30～40個(gè)基因簇，為系統(tǒng)挖掘這些基因簇的功能并繪制圖譜，已在互聯(lián)網(wǎng)上開放了一些生物信息工具。網(wǎng)絡(luò)工具SMURF(Secondary Metabolite Unknown RegionsFinder;www.jcvi.org/smurf/)就是其中之一。然而，大多數(shù)的次級(jí)代謝物基因簇由于基因沉默等原因，不能在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)生產(chǎn)的條件下得到表達(dá)。為激活并表達(dá)這些沉默的基因簇，學(xué)者們采用了多種技術(shù)手段，并使其能有效的在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用。其中不乏一些行之有效的案列，Bergmann等［28］于2007年通過操控激活一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的特定通路，激活了模式菌株(構(gòu)巢曲霉)的一條沉默代謝通路，使得兩種全新的次級(jí)代謝產(chǎn)物得以鑒定。而Bok［29］通過定向操縱染色質(zhì)狀態(tài)，去除一個(gè)染色質(zhì)中的沉默基因，使至少兩個(gè)基因簇被激活表達(dá)。2010年，Jorgensen等［30］控制黑曲霉的生長(zhǎng)條件，使其處于接近零生長(zhǎng)率的狀態(tài)，從而誘導(dǎo)黑曲霉的特殊次級(jí)代謝物基因簇發(fā)生表達(dá)。因此綜合多種技術(shù)手段使曲霉菌潛在次級(jí)代謝物的開發(fā)具有更大的可能性。

越來越多的報(bào)道表明，曲霉菌的代謝產(chǎn)物具有極大的商業(yè)潛力:其中多不飽和脂肪酸可作為食品添加劑或是燃料原料;聚酮化合物及非核糖體肽具有潛在的藥物治療作用;類異戊二烯被認(rèn)為是一種全新的健康食品;脂肽以及AFP源蛋白可作為抗真菌劑等等。隨著基因工程技術(shù)的成熟并不斷更新，為曲霉菌的開發(fā)開辟更多新的途徑，未來也將使更多非真菌源的化合物可被曲霉菌表達(dá)生產(chǎn)，在不遠(yuǎn)的未來曲霉菌定將成為多目標(biāo)表達(dá)的平臺(tái)。

3.2 展望

為充分探索和利用曲霉菌使其成為一個(gè)多目標(biāo)表達(dá)平臺(tái)，學(xué)者們不斷提出更多的新概念新構(gòu)想。如在新的生產(chǎn)菌種開發(fā)中應(yīng)盡可能的全部去除非目的次級(jí)代謝物基因簇，并以此作為工業(yè)生產(chǎn)分級(jí)的標(biāo)準(zhǔn)，即在對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量水平要求不同的工業(yè)領(lǐng)域(如燃料原料、飼料、食品、酶制劑、醫(yī)藥等)時(shí)，應(yīng)對(duì)應(yīng)不同要求開發(fā)不同的菌株。應(yīng)根據(jù)曲霉的密碼偏好型篩選曲霉菌或非真菌源的基因或基因簇，并在基因座中插入表達(dá)構(gòu)建體(expression constructs)，以使曲霉菌的基因表達(dá)得到最有效的操控。

此外，細(xì)胞器工程的發(fā)展也為曲霉菌細(xì)胞工廠的開發(fā)提供了一個(gè)新的構(gòu)思。胞內(nèi)蛋白可以通過peroxicretion途徑［31］進(jìn)行分泌(一種新的真核細(xì)胞的分泌途徑，該途徑通過在過氧化物酶體上人工裝飾高爾基體源的V-SNARE，使過氧化物酶體與細(xì)胞膜融合，再利用過氧化物酶的分泌囊泡將胞內(nèi)蛋白質(zhì)釋放到胞外)。

將曲霉菌生物技術(shù)、系統(tǒng)生物學(xué)工具以及代謝工程成功相互融合的關(guān)鍵，不僅要標(biāo)準(zhǔn)化控制曲霉菌培養(yǎng)生產(chǎn)的過程，更要通過生物信息學(xué)方法將獲得的轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組代謝組等大量組學(xué)數(shù)據(jù)合理有效的分析得到正確推論。建立以基因組為基礎(chǔ)的代謝模型并對(duì)代謝流合理分析是鑒定限制性通路并預(yù)測(cè)有益代謝工程的關(guān)鍵。而對(duì)曲霉菌的細(xì)胞生物學(xué)研究(諸如細(xì)胞的體內(nèi)影像監(jiān)控研究in vivo live imaging)對(duì)全面地了解曲霉菌的細(xì)胞內(nèi)工作過程也是必不可少的。這些新思路的提出必將促使曲霉菌細(xì)胞工廠的開發(fā)應(yīng)用走上一個(gè)嶄新的階段。

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