茉莉酸甲酯處理抑制鮮切梨褐變機(jī)理的研究

王艷穎，胡文忠，* ，姜 波，金黎明

(1.大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連116600;2.生物化學(xué)工程國(guó)家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116600)

鮮切果蔬又稱最少加工處理(mini-processed)果蔬，是指新鮮果蔬原料經(jīng)過挑選、清洗、去皮、切分、保鮮、包裝等處理，并使產(chǎn)品保持新鮮狀態(tài)的制品，由于鮮切果蔬具有新鮮、安全、方便等優(yōu)點(diǎn)，因而深受消費(fèi)者喜愛［1］。然而，與新鮮完整果蔬相比，鮮切果蔬由于加工過程中的切分，造成機(jī)械損傷，導(dǎo)致細(xì)胞破裂，膜透性增加，酚類物質(zhì)和多酚氧化酶(PPO)迅速接觸而導(dǎo)致果實(shí)發(fā)生酶促褐變，同時(shí)，自由基平衡系統(tǒng)受到破壞，膜脂過氧化加劇，造成果實(shí)衰老加速，使產(chǎn)品色澤、質(zhì)地、風(fēng)味下降，降低了鮮切果蔬的商品價(jià)值［2-4］，因而探索如何防止鮮切果蔬品質(zhì)劣變的保鮮技術(shù)至關(guān)重要。茉莉酸類物質(zhì)(JAs)包括茉莉酸(jasmonic acid，JA)和茉莉酸甲酯(methyl jasmonic acid，MeJA)，是植物天然產(chǎn)生的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，廣泛存在于植物界中。研究結(jié)果表明，茉莉酸(酯)類物質(zhì)是與抗性密切相關(guān)的植物生長(zhǎng)物質(zhì)。作為內(nèi)源信號(hào)分子參與植物在機(jī)械傷害、病蟲害、干旱、鹽脅迫、低溫等條件下的抗逆反應(yīng)。當(dāng)植物受到傷害時(shí)，植物體內(nèi)茉莉酸及其衍生物的含量顯著增加，進(jìn)而誘導(dǎo)一系列與抗逆有關(guān)的基因表達(dá)，如蛋白酶抑制劑、苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(PAL)等［5］。目前國(guó)內(nèi)有關(guān)茉莉酸甲酯在鮮切果蔬方面的研究很少，尤其缺乏果蔬褐變機(jī)理方面的研究，所以，本文采用茉莉酸甲酯處理鮮切水晶梨，研究其處理后鮮切梨酶促褐變的機(jī)制，從而為鮮切果蔬的保鮮加工技術(shù)提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試的水晶梨 購(gòu)于當(dāng)?shù)爻校暨x果形整齊，大小均勻，無(wú)病蟲害及機(jī)械損傷，色澤、成熟度一致的果實(shí)。

電子天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司;電導(dǎo)率儀 美國(guó)Thermo electron corporation;BR4i型高速冷凍離心機(jī) 法國(guó)Jouan;SiM-F140型制冰機(jī)日本三洋;T-25型勻漿機(jī) 德國(guó)IKA;UV-2100型紫外可見分光光度計(jì) 尤尼柯上海儀器有限公司;Lambda 25型紫外可見分光光度計(jì) 美國(guó)Perkin Elmer;CR400/CR410型色差計(jì) 日本Konica Minolta;組合式氣調(diào)庫(kù) 大連冷凍機(jī)股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 材料預(yù)處理 將梨果實(shí)用200μL/L的次氯酸鈉溶液浸泡5min后，再用雙蒸水多次清洗后，用鋒利的無(wú)菌刀在消毒后的菜板上去除果皮，然后將果實(shí)切成1.5cm×1.5cm的正方體小塊進(jìn)行以下3組處理:處理1和處理2分別用1、10μmol/L的茉莉酸甲酯溶液浸泡5min，對(duì)照果用雙蒸水浸泡5min，各處理果晾干后分別裝入保鮮盒內(nèi)置于室溫條件下貯藏。

1.2.2 相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定 參照席玙芳的方法［6］。

1.2.3 多酚含量的測(cè)定 參照 Singleton的方法［7］，單位以O(shè)D280nm/g FW表示，重復(fù)測(cè)定3次。

1.2.4 PPO、POD活性及MDA含量的測(cè)定

1.2.4.1 提取液的制備 取10g去皮果肉，加1g PVP于20mL 0.2mol/L磷酸緩沖液(pH6.4)中，冰浴研磨，4℃下13000r/min離心30min，取上清液測(cè)定酶活性和MDA含量。

1.2.4.2 PPO活性測(cè)定 參照Galeazzi等的方法［8］，酶活性以ΔOD398/min·g FW表示，樣品重復(fù)測(cè)定3次。

1.2.4.3 POD活性的測(cè)定 按照 Putter的方法［9］，酶活性以ΔOD460/min·g FW表示，樣品重復(fù)測(cè)定3次。

1.2.4.4 MDA含量的測(cè)定 參照Heath和Pacontroler的方法［10］，單位以 nmol/g FW 表示，樣品重復(fù)測(cè)定3次。

1.2.5 SOD活性的測(cè)定 采用SOD對(duì)NBT光化還原抑制的方法［11］。以抑制 NBT光化還原50%為1個(gè)酶活性單位，結(jié)果以U/g FWh表示。

1.2.6 CAT活性的測(cè)定 參照 Acbi方法［12］，CAT反應(yīng)體系包括粗酶液200μL和3mL 20mmol/L H2O2，以蒸餾水作參比。在240nm處測(cè)定2min內(nèi)的樣品吸光值，重復(fù)測(cè)定3次。

1.2.7 果實(shí)顏色的測(cè)定 用色差計(jì)測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 茉莉酸甲酯處理對(duì)鮮切梨相對(duì)電導(dǎo)率的影響

細(xì)胞質(zhì)膜完整性的破壞是果實(shí)衰老的重要標(biāo)志。細(xì)胞膜透性可以用相對(duì)電導(dǎo)率大小來(lái)衡量。如圖1所示，對(duì)照和處理果的相對(duì)電導(dǎo)率都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，說明切割等機(jī)械傷破壞了梨細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，造成細(xì)胞汁液外滲，導(dǎo)致相對(duì)電導(dǎo)率上升。而機(jī)械傷又會(huì)引發(fā)一系列與蛋白質(zhì)合成有關(guān)的代謝變化和包括細(xì)胞在內(nèi)的修復(fù)過程，其中最重要的就是新膜的生物合成［13］，使組織的失水和電解質(zhì)外滲得到控制，而且貯藏后期果實(shí)衰老加劇也會(huì)導(dǎo)致相對(duì)電導(dǎo)率逐漸下降。而處理組的相對(duì)電導(dǎo)率上升下降幅度較小，峰值比對(duì)照晚一天出現(xiàn)且后期明顯地高于對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，茉莉酸甲酯處理有效地保護(hù)了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，抑制了相對(duì)電導(dǎo)率的上升，從而延緩了梨組織的衰老，尤其處理1相對(duì)電導(dǎo)率貯藏前期最低，更有效地延緩了梨果實(shí)的衰老進(jìn)程。

圖1 茉莉酸甲酯對(duì)鮮切梨相對(duì)電導(dǎo)率的影響Fig.1 Effect of methyl jasmonate on relative electrical conductivity of fresh-cut pear

2.2 茉莉酸甲酯處理對(duì)鮮切梨多酚含量的影響

酚類物質(zhì)是果實(shí)酶促褐變的底物，在多酚氧化酶的作用下氧化成醌而導(dǎo)致果實(shí)褐變。如圖2所示，多酚含量在貯藏期呈現(xiàn)前期上升后期下降的趨勢(shì)，處理果多酚含量的變化明顯地慢于對(duì)照且變化幅度較小，而且處理1在貯藏前期一直保持最低水平?？赡苁乔懈顐ζ茐牧思?xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，酚類物質(zhì)外滲，導(dǎo)致多酚含量上升，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，果實(shí)衰老、褐變加劇，酚類物質(zhì)因消耗而逐漸減少。茉莉酸甲酯處理抑制了多酚含量的上升，減輕了梨果實(shí)酶促褐變的程度，尤其處理1效果更好。

圖2 茉莉酸甲酯對(duì)鮮切梨多酚含量的影響Fig.2 Effect of methyl jasmonate on polyphenol contents of fresh-cut pear

2.3 茉莉酸甲酯處理對(duì)鮮切梨多酚氧化酶(PPO)活性的影響

多酚氧化酶(PPO)在組織細(xì)胞內(nèi)以兩種形式存在，一種具有催化活性的游離態(tài)(FPPO)存在于細(xì)胞質(zhì)中;一種以潛在活性的結(jié)合態(tài)(BPPO)存在于細(xì)胞膜上，果蔬一旦遭到機(jī)械損傷，造成細(xì)胞質(zhì)膜的破裂，BPPO便游離出來(lái)，轉(zhuǎn)化為具有催化活性FPPO［14］。如圖3所示，對(duì)照和處理組的PPO活性都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，處理組的PPO活性在前期明顯地低于對(duì)照。因?yàn)榍懈顐ζ茐牧思?xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，大量的FPPO游離出來(lái)導(dǎo)致酶活性升高，把酚類物質(zhì)氧化成醌后而減少。而茉莉酸甲酯處理因有效地保護(hù)了膜結(jié)構(gòu)而抑制了PPO的活性，減弱了酶促褐變的趨勢(shì)，尤其處理1貯藏前期PPO活性最低，更有效地抑制了果實(shí)的褐變，保持了鮮切梨良好的貯藏品質(zhì)。

圖3 茉莉酸甲酯對(duì)鮮切梨PPO活性的影響Fig.3 Effect of methyl jasmonate on PPO activity of fresh-cut pear

2.4 茉莉酸甲酯處理對(duì)鮮切梨過氧化物酶(POD)活性的影響

POD是植物在逆境條件下酶促防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶之一，它與SOD、CAT相互協(xié)調(diào)配合，清除過剩的自由基，以提高植物的抗逆性［15］。如圖4所示，鮮切梨在貯藏過程中無(wú)論是對(duì)照還是處理組POD活性都呈現(xiàn)上升下降的反復(fù)趨勢(shì)，處理組的POD活性變化明顯地慢于對(duì)照，活性高峰比對(duì)照晚兩天出現(xiàn)，尤其處理1的酶活性代謝速度最慢。因?yàn)榍懈顐ζ茐牧四そY(jié)構(gòu)，導(dǎo)致H2O2的積累，從而誘導(dǎo)了POD活性的上升，以提高果實(shí)對(duì)傷脅迫的抗性，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，果實(shí)衰老加劇，清除自由基能力減弱，POD活性逐漸下降;而茉莉酸甲酯處理因保護(hù)了膜結(jié)構(gòu)，抑制了H2O2的積累，所以延緩了POD活性的上升，使貯藏后期鮮切梨保持了較好的貯藏品質(zhì)，POD保持較高的活性，具有較強(qiáng)的清除自由基能力。

圖4 茉莉酸甲酯對(duì)鮮切梨POD活性的影響Fig.4 Effect of methyl jasmonate on POD activity of fresh-cut pear

2.5 茉莉酸甲酯處理對(duì)鮮切梨丙二醛(MDA)含量的影響

果蔬組織中活性氧產(chǎn)生和清除之間的不平衡，導(dǎo)致活性氧的積累，從而促進(jìn)膜脂過氧化作用，MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物，其累積量的多少反映膜脂過氧化程度的高低［16］。如圖5所示，切割傷害導(dǎo)致對(duì)照果MDA含量初期快速升高后期快速下降，而處理組的MDA含量變化速度較慢，峰值與POD活性變化一致都比對(duì)照晚兩天出現(xiàn)。這可能是因?yàn)榍懈顐ζ茐牧缩r切梨細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，加速了活性氧的積累，促進(jìn)了膜脂過氧化。而茉莉酸甲酯處理有效地保護(hù)了膜結(jié)構(gòu)，促進(jìn)了細(xì)胞保護(hù)酶及時(shí)清除過剩的自由基，抑制了膜脂過氧化的進(jìn)程，從而延遲了MDA含量的上升。尤其處理1在貯藏前期MDA含量最低，膜脂過氧化進(jìn)程較緩慢，更有效地保持了鮮切梨的貯藏品質(zhì)。

圖5 茉莉酸甲酯對(duì)鮮切梨MDA含量的影響Fig.5 Effect of methyl jasmonate on MDA contents of fresh-cut pear

2.6 茉莉酸甲酯處理對(duì)鮮切梨超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響

超氧化物歧化酶(SOD)作為植物抗氧化系統(tǒng)的第一道防線，主要功能是清除細(xì)胞中多余的超氧陰離子，防止其對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)造成傷害［17］。如圖6所示，SOD活性在貯藏過程中都呈現(xiàn)上升下降的趨勢(shì)，但處理組的SOD活性變化明顯地慢于對(duì)照，活性高峰比對(duì)照晚一天出現(xiàn)，而且后期一直保持較高的活性。分析原因可能是切割傷害破壞了梨組織自由基代謝平衡，誘導(dǎo)了SOD活性的升高以清除多余的超氧陰離子，隨著貯藏期的延長(zhǎng)，組織衰老加速，清除超氧陰離子能力減弱，導(dǎo)致SOD活性下降;而茉莉酸甲酯處理因保護(hù)了膜結(jié)構(gòu)而維持了活性氧代謝平衡，推遲了SOD清除超氧陰離子的進(jìn)程。尤其處理1較對(duì)照誘導(dǎo)SOD活性較慢而且活性較強(qiáng)，對(duì)由傷脅迫和衰老導(dǎo)致自由基代謝不平衡而引發(fā)的膜脂過氧化起到了更有效的防御保護(hù)作用。

圖6 茉莉酸甲酯對(duì)鮮切梨SOD活性的影響Fig.6 Effect of methyl jasmonate on SOD activity of fresh-cut pear

2.7 茉莉酸甲酯處理對(duì)鮮切梨過氧化氫酶(CAT)活性的影響

果實(shí)衰老源于活性氧的積累，活性氧產(chǎn)生和清除之間的平衡被破壞導(dǎo)致活性氧的積累，使果實(shí)衰老加劇。CAT能分解代謝產(chǎn)生的H2O2而有效地清除自由基［18］。如圖7所示，梨果實(shí)經(jīng)切割后，CAT活性呈現(xiàn)前期上升后期下降的趨勢(shì)，它與SOD活性的變化趨勢(shì)相似，只是比SOD活性峰值晚了一天出現(xiàn)，處理果的CAT活性變化慢于對(duì)照且后期保持較高的活性。這可能是因?yàn)榍懈畹葯C(jī)械傷誘導(dǎo)了鮮切梨CAT活性的上升以清除過剩自由基，它與SOD相互協(xié)調(diào)配合對(duì)受傷害的細(xì)胞起到持續(xù)保護(hù)作用。而茉莉酸甲酯處理推遲了果實(shí)的老化進(jìn)程，抑制了CAT活性的快速上升，尤其處理1貯藏后期保持較高的CAT活性，仍然具有較強(qiáng)的清除自由基的能力，使果實(shí)保持良好的貯藏品質(zhì)。

圖7 茉莉酸甲酯對(duì)鮮切梨CAT活性的影響Fig.7 Effect of methyl jasmonate on CAT activity of fresh-cut pear

2.8 茉莉酸甲酯處理對(duì)鮮切梨L*值的影響

L*值是反映果實(shí)表面褐變最直觀的指標(biāo)參數(shù)，L*值越小，褐變?cè)絿?yán)重。由圖8可知，鮮切梨果實(shí)的顏色是逐漸下降的，但處理組的L*值下降較慢，而且始終高于對(duì)照，尤其處理1在貯期一直保持最高的水平，說明較低濃度的茉莉酸甲酯抑制鮮切梨的褐變效果最好。

圖8 茉莉酸甲酯對(duì)鮮切梨顏色L*的影響Fig.8 Effect of methyl jasmonate on colour L* of fresh-cut pear

3 結(jié)論與討論

3.1 褐變是植物組織普遍存在的一種生理現(xiàn)象，通常認(rèn)為是酚類物質(zhì)在氧的作用下，被多酚氧化酶(PPO)氧化成醌所致［3］。在正常發(fā)育的果實(shí)中，酚類物質(zhì)、氧和PPO通過一系列膜系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)區(qū)域性分布使果實(shí)不發(fā)生褐變，當(dāng)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞后，酚類物質(zhì)和多酚氧化酶的區(qū)域化分布被打破，酚類物質(zhì)不斷滲出與游離態(tài)的PPO接觸，從而引起果肉的酶促褐變［19］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，切割傷害破壞了梨果實(shí)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，使區(qū)域化分隔狀態(tài)的酚類物質(zhì)大量外溢，導(dǎo)致相對(duì)電導(dǎo)率快速上升，同時(shí)它與游離態(tài)的PPO接觸氧化而導(dǎo)致果實(shí)發(fā)生酶促褐變，表現(xiàn)為L(zhǎng)*值逐漸下降。而茉莉酸甲酯可能誘導(dǎo)了如新膜等蛋白質(zhì)的合成，維持了鮮切梨細(xì)胞膜的完整性，抑制了酚類物質(zhì)外泄和PPO活性的上升，減弱了梨果實(shí)酶促褐變的程度，特別是1μmol/L的茉莉酸甲酯處理的效果更好，果實(shí)褐變度最輕。

3.2 SOD、POD和CAT是植物體內(nèi)存在的清除自由基的保護(hù)酶，SOD主要催化的歧化反應(yīng)，使·轉(zhuǎn)變成和，后者再被CAT或POD分解和。正常情況下植物體內(nèi)的·處于產(chǎn)生與清除的動(dòng)態(tài)平衡中。逆境條件破壞了自由基代謝的平衡，引起膜脂過氧化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，切割傷害破壞了自由基代謝的平衡，果肉組織中的保護(hù)酶(SOD、POD、CAT)不能及時(shí)清除代謝產(chǎn)生的過剩自由基，引起膜脂過氧化加劇，表現(xiàn)為MDA含量的上升。同時(shí)傷脅迫逐漸地誘導(dǎo)細(xì)胞保護(hù)酶活性的增強(qiáng)，提高果實(shí)清除自由基的能力，說明鮮切梨果實(shí)的保護(hù)酶系統(tǒng)在抵抗逆境脅迫方面具有一定的相互協(xié)同作用。茉莉酸甲酯處理因?yàn)橛行У乇Ｗo(hù)了膜結(jié)構(gòu)而抑制了活性氧的積累，延緩了各種保護(hù)酶活性的快速增加，推遲了膜脂過氧化的進(jìn)程。另外，在處理組的果實(shí)開始衰老時(shí)，茉莉酸甲酯也可能參與誘導(dǎo)SOD、POD、CAT等細(xì)胞保護(hù)酶活性以進(jìn)一步提高對(duì)傷脅迫的抗性，使果實(shí)保持更好的貯藏品質(zhì)。尤其1μmol/L的茉莉酸甲酯處理更有效地降低了膜脂過氧化的速度，延遲了果實(shí)的衰老進(jìn)程，保持了鮮切梨更好的貯藏品質(zhì)。

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