平行試驗(yàn)法優(yōu)選黃芪總黃酮提取條件

張軍武 趙 琦

黃芪為常用補(bǔ)氣中藥，2010年版中國(guó)藥典規(guī)定黃芪為豆科植物蒙古黃芪［Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao］或膜莢黃芪［Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.］的干燥根［1］。黃芪的化學(xué)成分復(fù)雜［2～4］，包括皂苷類(lèi)，多糖類(lèi)，黃酮類(lèi)以及各種氨基酸、微量元素、生物堿類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)等。黃酮類(lèi)化合物是天然抗氧化劑家族中的重要成員之一，它具有很強(qiáng)的清除自由基和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化特性。研究顯示黃酮類(lèi)化合物可抑制動(dòng)脈粥樣硬化形成［5］，但是黃芪中黃酮類(lèi)化合物遇熱不穩(wěn)定，提取溫度不宜太高［6］，而且實(shí)際生產(chǎn)中以加熱回流為主要提取方法。因此，本文采用平行試驗(yàn)法優(yōu)選回流提取黃芪總黃酮的最佳溫度，以期為大生產(chǎn)提供參考。

材料與方法

1.儀器與試藥:(1)儀器:UV1102型紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海天美科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn));FA1004N電子分析天平(上海天平廠生產(chǎn));ZK－82A型真空干燥箱(上海實(shí)驗(yàn)儀器廠生產(chǎn));GKC－11－CR2型電熱恒溫水浴鍋(上海金橋科析儀器廠生產(chǎn))。(2)試藥:2年生黃芪采集于陜西省旬邑縣黃芪GAP基地，經(jīng)鑒定為蒙古黃芪［Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao］;蘆丁對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所(批號(hào):0080－9705);亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇等所用試劑均為分析純。

2.實(shí)驗(yàn)方法:(1)樣品制備:稱(chēng)取黃芪粗粉10g，共15份，分別置500ml燒瓶中，加入95%乙醇200ml，搖勻，加熱回流1h，放冷至室溫，濾過(guò)，濾液濃縮至適量，將得到的濃縮液定容至250ml容量瓶中，備用。(2)方法學(xué)考察:以蘆丁為對(duì)照品，采用紫外分光光度法測(cè)定總黃酮的含量。①對(duì)照品溶液的制備:精密稱(chēng)取在105～110℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品10.5mg，加95%乙醇定容于25ml容量瓶中，得到濃度為0.42mg/ml的溶液作為對(duì)照品溶液;②標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:精密吸取對(duì)照品溶液 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml;分別置于 10ml容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液0.3ml，放置6min;再加10%硝酸鋁溶液0.3ml，放置6min;最后加入4%氫氧化鈉溶液4ml;分別加95%乙醇至刻度，搖勻，放置15min，置比色皿中，在510nm波長(zhǎng)處測(cè)定。以吸光度A為縱坐標(biāo)，總黃酮含量(μg/ml)為橫坐標(biāo)計(jì)算回歸方程為:A=0.008940476C+0.3225，相關(guān)系數(shù) r=0.9983，線性范圍:8.4 ～42.0μg/ml;③供試品溶液的制備:精密吸取上述平行試驗(yàn)的樣品溶液1ml，置10ml容量瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線下方法操作，測(cè)定吸收度，由回歸方程求出稀釋液中總黃酮濃度;④精密度試驗(yàn):精密吸取供試品溶液，連續(xù)測(cè)定5次，記錄吸光度，結(jié)果RSD為1.74%，表明精密度良好;⑤穩(wěn)定性試驗(yàn):精密吸取供試品溶液，分別于10、20、30、40min測(cè)定1次，記錄吸光度，結(jié)果 RSD為1.33%，表明在40min內(nèi)穩(wěn)定性良好;⑥重復(fù)性試驗(yàn):精密吸取樣品溶液1ml，共5份，分別按供試品溶液制備方法操作，按上述色譜條件測(cè)定吸光度并計(jì)算含量，結(jié)果RSD為1.13%，表明本方法重復(fù)性良好;⑦加樣回收率試驗(yàn):精密吸取樣品溶液1ml，共5份，分別加適量蘆丁對(duì)照品，按供試品溶液制備方法進(jìn)行操作，測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果表明:回收率在95% ～100%之間，RSD為1.18%，加樣回收良好。

結(jié) 果

測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。由表1測(cè)定結(jié)果可以看出，60℃和70℃下總黃酮含量比較低，80℃時(shí)含量最高，當(dāng)提取溫度高于90℃以上時(shí)總黃酮含量有所下降。所以選擇80℃提取比較合適。

表1 黃芪總黃酮測(cè)定結(jié)果

討 論

從中藥中提取天然活性成分的方法很多，但是以溶劑提取法最為常用。溶劑提取法是選擇適當(dāng)溶劑將中藥中的化學(xué)成分提取出來(lái)，如果藥材沒(méi)有特殊性質(zhì)，則一般選擇加熱回流提取的方法，以便提高提取效率。對(duì)于大部分活性成分來(lái)說(shuō)，提取溫度的升高意味著活性的變化或者消失，因此，回流提取必須控制加熱溫度，以便最大限度地保護(hù)活性成分，發(fā)揮中藥制劑的最大療效。

黃芪總黃酮是黃芪抗氧化、清除自由基的主要活性成分，也是黃芪的主要活性成分;另外，在大生產(chǎn)過(guò)程中黃芪的傳統(tǒng)提取方法是加熱回流，提取溫度很容易升高至100℃;因此在黃芪總黃酮的提取過(guò)程中應(yīng)注意提取溫度的控制，以免總黃酮的生物活性受到破壞。

通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)［6，7］，結(jié)合生產(chǎn)安全并兼顧提取效率，設(shè)計(jì)60～100℃ 5個(gè)提取溫度，采用平行試驗(yàn)法優(yōu)選出乙醇回流提取黃芪總黃酮的最佳溫度。試驗(yàn)證明:乙醇回流提取黃芪總黃酮的最佳溫度為80℃。此溫度較為符合大生產(chǎn)實(shí)際情況，故可以進(jìn)行擴(kuò)大試驗(yàn)并推廣，從而為有效的提取黃芪總黃酮提供科學(xué)依據(jù)。

1 中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì).中國(guó)藥典［S］.1部.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:283－284

2 齊宗韶.黃芪化學(xué)成分的研究概況［J］.中草藥，1987，18(5):41

3 吳繼洲.內(nèi)蒙黃芪化學(xué)成分的研究(Ⅰ)［J］.中草藥，1982，13(8):3

4 王惠康.內(nèi)蒙黃芪化學(xué)成分的研究(Ⅱ)［J］.中草藥，1989，20(5):6

5 汪德清，丁保國(guó)，Neil TG，等.黃芪總黃酮對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化早期形成的影響［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2003，19(6):637 －640

6 趙海燕，沙瀛，陳洋東.黃芪中皂甙·黃酮和多糖綜合利用的工藝研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，30(5):2051 －2053

7 孔繁晟，賁永光，孫愛(ài)群，等.超聲法與連續(xù)回流法提取黃芪總黃酮的工藝對(duì)比研究［J］.中國(guó)藥房，2010，21(19):1752－1754