超聲波法提取益母草中多糖方法的研究

張金生，楊宏娟，李麗華，趙文濤，蔚永清

（1.遼寧石油化工大學化學與材料科學學院，遼寧撫順 113001；2.遼寧石油化工大學石油化工學院，遼寧撫順 113001）

益母草（Leonurus Japonicus Houtt），別名茺蔚、坤草，是一種草本植物，以花蕾期的地上部分的干品或鮮品入藥，有活血調(diào)經(jīng)，祛瘀生新，利尿消腫等功效，臨床多用于月經(jīng)不調(diào)、胎漏難產(chǎn)、痛經(jīng)及產(chǎn)后瘀血腹痛，素有“血家圣藥”、“經(jīng)產(chǎn)良藥”之稱[1]。目前對益母草中化學成分研究較多的主要是生物堿、二萜類、阿魏酸類、揮發(fā)油類等[2]。而對益母草多糖研究較少，多糖（polysaccharide）是構成生命的四大基本物質之一，多糖在增強免疫力、降血糖、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗衰老、抗凝血等方面發(fā)揮著生物活性作用[3]。因此，隨著多糖的制備、合成、食品科學及藥理學研究的不斷深入，多糖的應用將具有更廣闊的前景[4]。本試驗優(yōu)化了益母草多糖的提取工藝，以其為更好的利用益母草提供參考。

1 材料和儀器

1.1 實驗原料和試劑

益母草：采自撫順市千金鄉(xiāng)。乙醇、葡萄糖、正丁醇、氯仿、濃硫酸、苯酚等均為分析純試劑。

1.2 儀器

超聲波清洗器：天津市琛航科技儀器有限公司；可見分光光度計：上海達平儀器有限公司；遠紅外輻射干燥箱：上海陽光實驗儀器有限公司；低速離心機：北京醫(yī)用離心機廠。

2 方法

2.1 超聲波提取益母草多糖

稱取1 g益母草粉末，放入錐形瓶中，利用超聲波提取，冷卻，布氏漏斗過濾，棄去濾渣，用旋轉蒸發(fā)儀使濾液濃縮，用Savage法除蛋白，向濃縮液中加入氯仿和正丁醇的混合液（體積比為4∶1），反復強烈振蕩，直到在280 nm處沒有紫外吸收峰為止，加入3倍體積的95%乙醇溶液，靜置過夜，4000r/min離心20 min，無水乙醇、丙酮洗滌至無色，烘干，得益母草粗多糖。

2.2 樣品多糖含量的測定

本實驗采用苯酚－硫酸法測定多糖含量。稱取樣品多糖5mg至50mL的容量瓶中配置成0.1mg/mL的多糖溶液，按照2.1的方法測其吸光度值，并通過運用線性回歸方程計算其對應的多糖濃度，進而利用多糖的計算公式求出多糖的得率。計算公式如下：

式中:C為多糖質量濃度，（mg/mL）；D為稀釋倍數(shù)；V為體積，mL；M為多糖的總質量，mg；m為配制樣品溶液的多糖質量，mg；W為原藥材質量，g。

3 結果與討論

3.1 標準曲線的繪制

準確稱取干燥至恒重的葡萄糖0.100 2 g，加蒸餾水定容在100 mL的容量瓶中，分別移取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL至25 mL的容量瓶中，加入蒸餾水至刻度搖勻，再分別移取1 mL于具塞試管中，加入1 mL 6%的苯酚，并迅速滴加濃硫酸6 mL，沸水加熱30 min，冷卻至室溫，同時用蒸餾水做空白試驗。在492 nm處測定吸光度A，以葡萄糖濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度A為縱坐標，可得回歸方程為：y=0.124x-0.006 4，R2=0.999 6。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 The standard curve of the glucose

3.2 超聲波法提取益母草中多糖的單因素試驗

3.2.1 提取時間對多糖提取率的影響

稱取益母草樣品0.5 g，料液比為1∶15（g/mL），溫度35℃，提取益母草多糖時間分別為5、10、15、20、25 min，結果如圖 2 所示。

圖2 提取時間對多糖得率的影響Fig.2 Effects of the extraction time on extraction rate

由圖2可知，多糖得率隨著提取時間增長而增大，當時間達到15 min時得率最大，之后時間越長得率反而減少，這可能是由于長時間的超聲提取不能使多糖完全溶出，但由于超聲波對多糖的機械效應，時間過長會破壞多糖的結構，影響多糖的得率。

3.2.2 料液比對多糖提取率的影響

稱取益母草樣品 0.5 g，料液比為 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL），溫度 35 ℃，提取益母草多糖15 min，結果如圖3所示。

圖3 料液比對多糖得率的影響Fig.3 Effects of the solid to liquid on extraction rate

由圖3可知，多糖的得率隨著料液比的增大而增加，當料液比達到 1∶15（g/mL）時得率最大，之后料液比越大多糖得率反而下將?？赡苁侨軇┝窟^小時，多糖溶出不完全；溶劑量過大時，超聲波輻射又被溶液大量吸收，不能完全作用于物料，從而影響多糖提取率[5]。

3.2.3 溫度對多糖提取率的影響

稱取益母草樣品 0.5 g，料液比為 1∶15（g/mL），溫度 15、25、35、45、55 ℃，提取益母草多糖 15 min，結果如圖4所示。

圖4 提取溫度對多糖得率的影響Fig.4 Effects of the extraction on extraction rate

由圖4可知，多糖得率隨著溫度的升高而增大，當溫度達到55℃時多糖得率最大，之后隨著溫度繼續(xù)增高得率反而減少，可能是由于植物多糖不易溶于低溫的水，而溫度過高會使多糖水解變質，從而影響得率。

3.3 正交試驗設計及結果分析

為了優(yōu)化提取工藝，本試驗通過對單因素的考察，選擇了對提取率影響較大的3個因素：提取時間（A）、料液比（B）、反應溫度（C），進行三因素三水平的正交試驗。由多糖得率為試驗指標來確定最佳的提取工藝。正交試驗因素水平如表1，正交試驗結果如表2。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

由表2中的極差分析可知，影響益母草多糖得率的順序為B＞A＞C，即料液比＞提取時間＞提取溫度。由正交試驗結果可知最佳的提取工藝條件為A2B2C2，即提取時間為 15 min，料液比為 1∶15（g/mL），提取溫度為35℃。

表2 正交試驗結果及直觀分析Table 2 The test resulst and the visual analysis of the orthogonal test

3.4 最佳工藝條件的驗證

按A2B2C2組合進行5次平行試驗，提取率為3.24%。再按A3B2C3組合進行5次平行試驗，提取率為3.11%。由此可知，超聲波法提取益母草中多糖最佳的提取工藝為A2B2C2，即提取時間為15 min，料液比為 1∶15（g/mL），提取溫度為 35 ℃。

3.5 穩(wěn)定性試驗

稱取1 mL的樣品溶液，按2.1法每隔半個小時（30 min）測定一次吸光度，結果如表3所示，RSD為0.34%。

表3 穩(wěn)定性試驗結果Table 3 The test results of the stability

3.6 精密度試驗

稱取1 mL相同的樣品溶液5份，按2.1法測得樣品的吸光度值，結果如表4所示，其RSD為0.39%。

表4 精密度試驗結果Table 4 The test results of the precision

3.7 加標回收率試驗

精密稱取益母草粗多糖5份，加入與測得多糖的含量相近的葡萄糖粉末，按2.1法得樣品的吸光度值，計算出平均加標回收率為93.04%，RSD為2.03%，結果如表5所示。

表5 加標回收率試驗結果（n=5）Table 5 The test results of the recovery（n=5）

4結論

采用超聲波法提取益母草多糖并通過正交試驗設計優(yōu)化益母草多糖的提取工藝，其最佳提取工藝為提取時間15 min，料液比1∶15，提取溫度35℃，在最佳工藝條件下的提取率為3.24%。比文獻[6]報道益母草多糖的提取率低了1.62%，但是提取時間縮短了7倍。由于益母草價格低廉、易得，同時具有一定的藥理作用，且此方法方便、簡單快捷、不引進雜質，為益母草的進一步開發(fā)利用提供了參考。

采用苯酚－硫酸法測定益母草中多糖的含量，根據(jù)多糖在有濃硫酸的條件下先水解成單糖，同時迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚生成糖醛衍生物，此物質在波長480 nm～490 nm處吸光度值與糖濃度呈一定的線性關系，從而得出多糖濃度。此方法的試劑易得、簡便快捷，同時益母草多糖在此法顯色后3 h內(nèi)穩(wěn)定、回收率高。

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