全自動毛細管電泳儀在血紅蛋白分析中的應用

阮麗明，周艷潔，丁進龍，梁立陽，何桂瓊，梁 蕭，蘇國生

（1.南寧市人口和計劃生育服務中心，廣西 南寧 5300222.南寧市第四人民醫(yī)院，廣西 南寧 530023）

血紅蛋白病可分為異常血紅蛋白病和地中海貧血（地貧），地中海貧血是我國南方最常見和危害最大的遺傳病之一[1-2]，廣西是地貧的高發(fā)區(qū)[3]。根據地貧病變發(fā)生的珠蛋白鏈不同可分為α地貧和β地貧。分離量化和鑒定患者的血紅蛋白成分對于地貧各種類型的臨床診斷及治療具有重大意義。毛細管血紅蛋白電泳能夠定量檢測血紅蛋白A(HbA)、血紅蛋白F-(HbF)、血紅蛋白A2(HbA2)含量以及其他異常血紅蛋白，可用于診斷地中海貧血及其他血紅蛋白病[4]。為了解全自動毛細管電泳儀在血紅蛋白分析中的臨床應用價值，本研究針對5088例項目人群進行電泳分析，現將結果報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 2009年1～9月，對分布在南寧市6城區(qū)及所轄6縣（共96個鄉(xiāng)鎮(zhèn)）的5457對（10914人）年齡20～40歲（廣西籍10907人、廣東籍5人、四川籍2人）的農村新婚夫婦進行地貧篩查。對篩查人群中血常規(guī)一方或雙方異常[紅細胞平均體積（MCV）＜80 fl]的5088例進行毛細管電泳分析，并選出229例做地貧基因分析。

1.2 方法

1.2.1 標本的采集及處理 用一次性真空采血管（含EDTAK2抗凝劑）采集上述人群靜脈血2～3 ml，搖勻抗凝。

1.2.2 毛細管區(qū)帶電泳 采用法國Sebia公司生產的Cap2illarys 2全自動毛細管電泳儀（The Capillary Sebia，Parc Leonard de Vinci，CP 8010 Lisses，91008 EVRY，France）（法國Sebia公司6.11軟件版本Capillarys@）及其配套血紅蛋白電泳試劑盒CAPILLARYSHEMOGLOB IN（E）。（CAT No.19096、09107、12037）。按照儀器操作說明書進行，抗凝標本直接離心取沉淀紅細胞加入試管中（標本量＞200μl）。把裝有標本的試管按順序放在儀器配套的檢測架上（一個檢測架一次一批可檢測7個標本，可同時檢測多批標本），在檢測架第八管位置加入大約4 ml的溶血試劑。把檢測架送入Cap illarys 2全自動毛細管電泳儀進行血紅蛋白電泳檢測，約30 min后全部檢測程序完畢，查看結果。

1.2.3 質控品準備 取SEB IA公司提供的正常HbA2質 控 品[（SEBIA，PN 4778）CAT No.25055、21105）]。用1 ml蒸餾水或去離子水溶解，把溶解的質控品加入一個微型試管中。除去微型試管管帽。把此微型試管放入一個作為底座的新溶血試管，放置于樣品架No.0的1號位置，按上述標本步驟測定。

1.2.4 基因檢測 3種常見缺失型α地貧基因分析采用Gap-PCR技術，3種非缺失型α地貧基因和17種β地貧基因分析采用反向斑點雜交技術（RDB），用深圳益生堂生物企業(yè)有限公司生產的全血基因組提取試劑盒和基因診斷試劑盒進行檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法 對實驗數據分布范圍的統(tǒng)計，使用SPSS 14.0統(tǒng)計學軟件。

2 結果

2.1 血紅蛋白電泳的檢測結果 10914人中對MCV＜80 fl的5088例標本進行電泳，發(fā)現異常1042例，其中β地貧757例（HbA2＞4.0%），HbF增高23例，HbCS262例，見表1。

表1 毛細管電泳異常結果

5088例標本中選出229例同時進行毛細管電泳和地貧基因檢測，以基因為金標準，比較毛細管電泳篩查α和β地中海貧血中常見異常區(qū)帶的符合率。229例標本基因檢測結果：正常有50例，β地中海貧血74例，異常血紅蛋白E(HbE)7例、血紅蛋白H(HbH)病46例、異常血紅蛋白(HbCS)40例。以上病例的毛細管電泳分析顯示每個血紅蛋白顯示的鋒都出現在特定的區(qū)域：HbCS=Z2、HbA2=Z3、HbE=Z4、HbF=Z7、HbA=Z9、HbH=Z15、血紅蛋白 Bart's(Hb-Bart's)=Z12。

2.2 毛細管電泳對β地中海貧血及異常HbE的篩查β地貧患者毛細管電泳HbA2（Z3）74例都出現增高，其中59例伴有HbF增高（見表2）。7例HbE存在時，同樣可對HbA2定量（見圖1）。

2.3 毛細管電泳對α地中海貧血中異常區(qū)帶的篩查 46例HbH病電泳中出現HbH區(qū)帶（Z15）23例，HbH+HbBart's區(qū)帶18例，合并有HbCS區(qū)帶（Z2）4例（見圖2）；有1例HbH病在電泳檢測中漏診，與基因結果符合率為97.83%，這1例的基因型為-SEA/-α 3.7。Hb Constant Spring（HbCS）雜合子40例中有2例未檢出，與基因符合率為95.00%（見表3）。

表2 毛細管電泳對β地中海貧血及HbE雜合子測定結果（±s，%）

表2 毛細管電泳對β地中海貧血及HbE雜合子測定結果（±s，%）

類型 例數HbF HbA 2 HbE 與基因符合率β地貧HbE雜合子747 1.2±1.0（59例）5.3±1.14.0±0.4724.3±3.2100100

表3 HbH病及HbCS雜合子電泳結果分析（±s,%）

表3 HbH病及HbCS雜合子電泳結果分析（±s,%）

類型HbH病HbCS雜合子例數4538 HbH 4.3±3.3(23例）-HbBart's 1.4±1.0（18例）-HbA 2 1.0±0.22.2±0.2 HbCS 3.5±0.4（4例）0.77±0.78與基因符合率97.8395.00

圖1 HbE雜合子（βE）HbF：0.9%，HbE26.5%，HbA2：3.8%

圖2 HbH?。?-SEA/aaCS）HbH：6.3%，HbBart`s：1.5%HbCS：3.2%

3 討論

全自動毛細管電泳法是在充滿電泳液的石英毛細管中進行電泳的技術，在溶血試劑中進行稀釋的紅細胞樣品，會被注射到毛細管的負極端，在高壓電的作用下競相電泳分離，然后Hb會被靠近正極端的415 nm光波檢測裝置檢測到[5]。通過毛細管電泳將蛋白質分離，采用波長為200 nm氘光源和CCD探測器，對血紅蛋白成分分析靈敏度和分辨率高[6]。我們對法國Sebia公司Cap illarys 2全自動毛細血管電泳系統(tǒng)進行了評價，證明該系統(tǒng)具有較高的精密度及準確度。直接檢測可準確地對各種血紅蛋白組份相對定量，尤其是那些重要的組份，例如HbA、HbA2、HbE、HbF、HbH、HbBart's、HbCS。在α地貧中，成人用毛細管血紅蛋白電泳方法檢出的異常區(qū)帶有HbH、HbBart's和HbCS，HbH病和HbCS與基因分析的符合率為97.83%和95.00%，漏診的主要原因可能與不穩(wěn)定血紅蛋白的降解有關。β地貧主要表現為HbA2、HbF增高，毛細管電泳與基因基因診斷結果吻合。HbE是由β珠蛋白基因第26位的谷氨酸被賴氨酸取代所產生，是一種β地貧樣的血紅蛋白病[7]。HbE存在時，同樣可對HbA2定量。毛細管區(qū)帶電泳對血紅蛋白變異體的分辨效果好，用此方法分離血紅蛋白，可對與α地中海貧血相關的血紅蛋白血癥進行鑒別診斷[8-9]。全自動毛細管電泳法且具有樣品處理簡單、自動化程度高、檢測時間短等優(yōu)勢[10]。所以我們認為全自動毛細管電泳法基本可以為地中海貧血及血紅蛋白病篩查及診斷提供快速準確的診斷依據。但在實際應用過程中應注意以下幾點：①標本采集后應在7 d內完成測定，電泳前放置冰箱2℃～8℃保存，否則對HbCS、HbH、Hb Bart's等的不穩(wěn)定的血紅蛋白易造成降解。②毛細管電泳分析無法檢出α地貧-1和α地貧-2，所以對血常規(guī)Hb、MCV、MCH降低的患者，在排除缺鐵性貧血、自身免疫性溶血等因素后，HbF、HbA2值正常且未檢出異常區(qū)帶者，應做分子生物學檢測地貧基因來排除輕型α地貧患者。③對電泳出現有A2變異體或其他異常血紅蛋白的標本可以結合軟件中給出的區(qū)帶提示去初步分析和判斷，對異常區(qū)帶的最后診斷要進行基因分析測序確認。

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