熒光定量RT-PCR檢測(cè)宮頸癌患者外周血MMP-9 mRNA表達(dá)的臨床意義

董小躍，張盛燕

（瑞安市婦幼保健院婦產(chǎn)科，浙江 瑞安 325200）

宮頸癌是常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一。雖宮頸癌的診斷及治療方面取得一定的進(jìn)展，但仍有20%～34%的早期宮頸癌患者最終死于腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。血循環(huán)中微轉(zhuǎn)移的存在，提示腫瘤已不再局限于原發(fā)灶，有發(fā)展為遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的可能。早期診斷外周血中的微轉(zhuǎn)移，有助于我們更有針對(duì)性地進(jìn)行個(gè)體化的術(shù)后輔助治療，減少?gòu)?fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。本研究利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)早期宮頸癌外周血中上皮源性特異性標(biāo)志基因MMP-9 mRNA的表達(dá)，探討它們?cè)趯m頸癌外周血中的表達(dá)及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2005年1月至2010年6月間我院首診的98例宮頸癌患者為研究對(duì)象。年齡22～78歲，平均48歲。臨床分期[按照2000年國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)的標(biāo)準(zhǔn)]：ⅠA期8例，ⅠB期48例，ⅡA期7例，ⅡB 22例，Ⅲ期10例，Ⅳ期3例。按病理類(lèi)型：鱗癌85例，非鱗癌13例；所有早期宮頸癌患者均予子宮次廣切或子宮廣切及盆清術(shù)，術(shù)后標(biāo)本均行病理檢查。對(duì)照組為同期手術(shù)的婦科良性腫瘤25例，其中子宮肌瘤18例，卵巢囊腫3例，子宮肌腺癥1例，子宮內(nèi)膜異位癥3例。

1.2 主要試劑和儀器 Trial試劑(GIBLO公司)；逆轉(zhuǎn)錄酶M2MLV(Promega公司)；Taq酶(Sangon公司)；Light Cycler熒光PCR儀(德國(guó)Roche公司)。

1.3 方法 患者初診治療前抽取靜脈血5 ml(棄去開(kāi)始的1 ml，以防上皮細(xì)胞污染)，于20 min內(nèi)用淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞。用Trizol試劑(上海復(fù)星公司)進(jìn)行總RNA的提取。測(cè)A260～280處的吸光值，并計(jì)算RNA含量。然而進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA后再行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：93℃ 2 min，93℃ 45 s，55℃ 60 s，共做40個(gè)循環(huán)。結(jié)果分析參考試劑盒。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌及婦科良性腫瘤的MMP-9 mRNA轉(zhuǎn)錄 宮頸癌組外周血MMP-9 mRNA有75例陽(yáng)性，表達(dá)率為76.5%(75/98)，而對(duì)照組有12例陽(yáng)性，表達(dá)率為48.0%(12/25)，兩組比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。在宮頸癌組內(nèi)，早期（ⅠA+ⅠB+ⅡA）宮頸癌外周血MMP-9 mRNA有40例陽(yáng)性，表達(dá)率為63.5%(40/63)，而中晚期（ⅡB+Ⅲ+Ⅳ）宮頸癌有31例陽(yáng)性，表達(dá)率為88.6%(31/35)，兩組比較差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 MMP-9 mRNA的表達(dá)與早期宮頸癌的單因素分析 ①年齡：年齡＜40歲的早期宮頸癌MMP-9 mRNA表達(dá)陽(yáng)性與陰性比例分別為16例(40.0%)vs 4例(17.4%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。②腫瘤分期：早期宮頸癌ⅠA、ⅠB、ⅡA MMP-9 mRNA表達(dá)陽(yáng)性與陰性比例分別為6例(15.0%)vs2例(8.7%)，30例(75%)vs 18例(78.3%)，4例(10.0%)vs 3例(13.0%)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。③病理類(lèi)型：早期宮頸癌病理類(lèi)型中非鱗癌MMP-9 mRNA表達(dá)陽(yáng)性與陰性比例分別為10例(25%)vs 2例(8.7%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。④病理分化：表達(dá)MMP-9 mRNA的早期宮頸癌與未表達(dá)MMP-9 mRNA的早期宮頸癌低分化分別有14例(35%)和4 例(17.4%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。⑤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：早期宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者M(jìn)MP-9 mRNA表達(dá)陽(yáng)性與陰性比例分別為6例(15%)vs 2例(8.7%)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表1。

表1 MMP-9 mRNA的表達(dá)與早期宮頸癌臨床病理因素分析

3 討 論

宮頸癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致治療失敗及造成患者死亡的主要原因[1]，因此，如何更早發(fā)現(xiàn)亞臨床期病變、評(píng)估治療效果、監(jiān)控復(fù)發(fā)是當(dāng)前需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題。而腫瘤的微轉(zhuǎn)移[2]是腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)和前提.因此早期診斷腫瘤的微轉(zhuǎn)移對(duì)指導(dǎo)個(gè)體化治療和判斷預(yù)后具有重要臨床價(jià)值。RT-PCR技術(shù)的靈敏性較高，可檢出1×107個(gè)正常細(xì)胞中的1個(gè)腫瘤細(xì)胞，使外周血微轉(zhuǎn)移檢測(cè)成為可能。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)（PCR）作為一項(xiàng)新技術(shù)，可檢測(cè)出106～108個(gè)單個(gè)核細(xì)胞中的一個(gè)腫瘤細(xì)胞，其巧妙地把核酸擴(kuò)增、雜交、光譜分析和實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)結(jié)合在一起，借助熒光信號(hào)檢測(cè)PCR產(chǎn)物。與普通PCR或巢式PCR相比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有更可靠的靈敏度和特異性，其自動(dòng)化的檢測(cè)能最大限度減少污染，顯著減少假陽(yáng)性的發(fā)生率[3]。

基質(zhì)金屬蛋白酶是一個(gè)大家族，因其需要Ca2+、Zn2+等金屬離子作為輔助因子而得名?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）幾乎能降解細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）中的各種蛋白成分，破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性作用，從而在腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中的作用日益受到重視，被認(rèn)為是該過(guò)程中主要的蛋白水解酶。MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)家族中的一員，為Ⅳ型膠原酶，可有效降解基底膜的主要成分Ⅳ型膠原及明膠，它的異常表達(dá)與人類(lèi)許多惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞角蛋白的存在，則意味著微轉(zhuǎn)移的發(fā)生[4]。

本研究采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)宮頸癌外周血中MMP-9 mRNA的轉(zhuǎn)錄。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MMP-9 mRNA在宮頸癌和對(duì)照組中的陽(yáng)性率分別為76.5%和48.0%，兩者差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。在宮頸癌中，中晚期宮頸癌外周血MMP-9 mRNA陽(yáng)性率明顯高于早期宮頸癌(88.6%vs 63.5%)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。以上資料表明在宮頸癌外周血中存在表達(dá)MMP-9 mRNA的腫瘤細(xì)胞；同時(shí)MMP-9 mRNA的轉(zhuǎn)錄均顯示了很高的特異性，通過(guò)RT-PCR技術(shù)檢測(cè)宮頸癌外周血中腫瘤細(xì)胞具有較好的敏感性和特異性。

目前，盡管早期宮頸癌的5年生存率達(dá)85%～90%，但臨床醫(yī)師發(fā)現(xiàn)一部分無(wú)高危因素的，術(shù)后很快發(fā)生盆腔復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的患者，預(yù)后較差。有關(guān)預(yù)后因素的探討被引為宮頸癌臨床處理依據(jù)或參考的有：腫瘤體積大小、宮頸間質(zhì)浸潤(rùn)深度、宮頸癌生長(zhǎng)形態(tài)及癌細(xì)胞類(lèi)型、淋巴血管受侵、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤組織非鱗癌成分；以及手術(shù)標(biāo)本切緣與年齡、貧血[5]。文獻(xiàn)報(bào)道，MMP-9 mRNA的轉(zhuǎn)錄與胃腸道、肺、乳腺等惡性腫瘤的預(yù)后因素如分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[6]。在本研究中，表達(dá)MMP-9 mRNA的早期宮頸癌與未表達(dá)MMP-9 mRNA的早期宮頸癌相比，年輕、低分化及鱗癌更多見(jiàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述資料提示微轉(zhuǎn)移可能與上述因素有關(guān)，而其作用機(jī)制有待進(jìn)一步探索和證實(shí)。對(duì)于MMP-9 mRNA患者給予加強(qiáng)預(yù)后監(jiān)測(cè)或預(yù)防性治療，可減少遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，改善預(yù)后，提高生存率。

[1]牟 玲,呂鳳林,汪 云,等.HPV18 E2基因在宮頸癌及癌前病變組織中的表達(dá)及其臨床意義[J].重慶醫(yī)學(xué),2008,37(20):2321-2324.

[2]賈學(xué)慧.人乳頭狀瘤病毒及其致病的研究進(jìn)展[J].海南醫(yī)學(xué),2010,21(18):111-114.

[3]Kim JT,Song EY,Chung KS,et al.Up-regulation and clinical significance of serine protease kallikrein 6 in colon cancer[J].Cancer,2011,117(2):2608-2019.

[4]Lakatos G,Sipos F,Miheller P,et al.The Behavior of Matrix metalloproteinase-9 in lymphocytic colitis,collagenous colitis and ulcerativecolitis[J].Pathol Oncol Res,2011,7(16):120-123.

[5]Agorastos T,Zafrakas M,Mastrominas M.Long-term follow-up after cervical cancer treatment and subsequent successful surrogate pregnancy[J].Reprod Biomed Online,2009,19(2):250-251.

[6]Marcaccini AM,Novaes AB JR,Meschiari CA,et al.Circulating matrix metalloproteinase-8(MMP-8)and MMP-9 are increased in chronic periodontal disease and decrease after non-surgical periodontal therapy[J].Clin Chim Acta,2009,409(1-2):117-122.