維生素D受體基因Fok I多態(tài)性與1型糖尿病的相關(guān)性研究

杜弢 廖嵐 李萬根 周智廣

[摘要] 目的 探討維生素D受體（VDR）基因Fok I位點多態(tài)性與1型糖尿?。═1DM）的關(guān)系。 方法 研究納入T1DM患者241例和正常對照組380例。VDR基因Fok I位點基因型采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片斷長度多態(tài)（PCR-RFLP）法檢測。 結(jié)果 T1DM組VDR基因Fok I基因型分布和F/f等位基因頻率與對照組比較，兩者間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。在T1DM組中，F(xiàn)f基因型組與ff基因型組的空腹-C肽（FCP）和餐后C-肽（PCP）均低于FF基因型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 VDR基因Fok I多態(tài)性與T1DM遺傳易感性不相關(guān)。T1DM患者中ff基因型與Ff基因型組FCP和PCP呈低水平，提示VDR 基因Fok I基因型可能與胰島細胞功能相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 1型糖尿?。痪S生素D受體基因；多態(tài)性；相關(guān)性

[中圖分類號] R587.1[文獻標識碼] A[文章編號] 1674-4721（2012）07（c）-0005-03

Association study between the VDR gene Fok I polymorphism and type 1 diabetes

DU Tao1 LIAO Lan2 LI Wangen1 ZHOU Zhiguang3▲

1.Department of Endocrinology, the Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangdong Province, Guangzhou 510260, China; 2.Department of Endocrinology, the Xiangya Hospital of Central South University, Hunan Province, Changsha 410008, China; 3.Institute of Metabolism and Endocrinology, the Second Xiangya Hospital of Central South University, Hunan Province, Changsha 410011, China

[Abstract] Objective To explore the association between the VDR gene Fok I polymorphism and type 1 diabetes (T1DM). Methods Two hundred and forty-one T1DM patients and 380 healthy subjects were recruited in the research. Length polymorphism polymerase chain reaction (RFLP-PCR) was performed to identify VDR gene Fok I genotypes. Results No differences were observed between T1DM and controls in VDR Fok I genotype distribution and allele frequencies (P > 0.05). In T1DM group, however, lower levels of fasting C-peptide (FCP) and postprandial C-peptide (PCP) were found in Ff and ff genotypes than FF genotype, the differences were statistical significance (P < 0.05). Conclusion There is no association between the VDR gene Fok I genotype and T1DM. VDR gene Fok I Ff and ff genotypes showe lower FCP and PCP levels, which suggest the VDR gene Fok I genotype is associated with islet cell function in T1DM.

[Key words] Type 1 diabetes; VDR gene; Polymorphism; Association study

1型糖尿病（T1DM）屬自身免疫性疾病，以T淋巴細胞免疫介導(dǎo)的胰島B細胞功能破壞為特征[1]。T1DM發(fā)病機制復(fù)雜，為遺傳因素和環(huán)境因素交互作用的結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)維生素D受體（VDR）與維生素D復(fù)合物后可抑制T細胞活性[2]，VDR基因多態(tài)性可能與其與復(fù)合物結(jié)合能力相關(guān)，進而影響T細胞介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)作用。目前國外已有研究報道維生素D受體基因Fok I多態(tài)性與T1DM易感性的關(guān)系，但結(jié)論不一致[3-10]。本研究通過分析380例正常對照者和241例T1DM患者VDR基因Fok I多態(tài)性分布特點，探討VDR 基因Fok I多態(tài)性與T1DM易感性及胰島細胞功能的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 T1DM組入組條件：符合1999年世界衛(wèi)生組織（WHO）糖尿病診斷和分型標準，患者起病6個月內(nèi)出現(xiàn)自發(fā)酮癥或酮癥酸中毒，GADA≥0.05，排除繼發(fā)性糖尿病。共納入患者241例，其中，男性133例，女性108例，平均年齡（24.7±13.2）歲。

1.1.2 正常對照組入組條件：經(jīng)檢查體格健康，且經(jīng)75 g口服葡萄糖耐量試驗（OGTT）檢測為正常糖耐量者，并排除高血壓、冠心病及腎病等內(nèi)分泌代謝性疾病病史，且均無糖尿病家族史。共納入對照者380例，其中，男261例，女119例，平均年齡（61.4±9.8）歲。

以上入選對象均為中國湖南地區(qū)漢族彼此間無親緣關(guān)系的人群，入組時間為2005年1月～2008年2月。

1.2 研究對象臨床基本資料和血清生化檢測

對所有研究對象進行身高、體重、收縮壓（SBP）及舒張壓（DBP）測量，并計算體重指數(shù)（BMI）。受試者進行OGTT時于0及120 min取血，采用葡萄糖氧化酶法測血漿葡萄糖。采用放射免疫法測定血清C肽（三V公司放免試劑盒，XH-6010型x放射免疫計數(shù)儀），批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為4.8%和8.9%。放射配體法檢測GADA，敏感性和特異性分別為82%和98%。

1.3 VDR基因Fok I多態(tài)位點基因型的檢測

采用常規(guī)苯酚-氯仿法提取外周血基因組DNA，用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片斷長度多態(tài)性（PCR-RFLP）方法檢測多態(tài)位點基因型。以100 ng DNA為模板在20 μL體系內(nèi)進行PCR擴增（Gene Amp PCR System 9700，Applied Biosystem，美國），引物序列F：5′-AGC TGG CCC TGG CAC TGA CTC TTG CTC T-3′；R：5′-ATG GAA ACA CCT TGC TTC TTC TCC CTC-3′。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；后進入循環(huán)，94℃變性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)；最后72℃終末延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳確認擴增結(jié)果后，進行Fok I限制性核酸內(nèi)切酶 （NEB公司，美國）水解，VDR基因PCR產(chǎn)物37℃酶切過夜。酶解產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳（110 V，45 min），以Goldview核酸染料染色，Gel Doc 2000凝膠成像儀下分析PCR產(chǎn)物以及酶切PCR產(chǎn)物，確定樣本基因型。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

統(tǒng)計分析用SPSS 13.0軟件包完成?；蛐头植甲鱄ardy-Weinberg 吻合度檢驗；組間計數(shù)資料比較采用χ2檢驗；計量資料的兩組間比較采用獨立樣本的t檢驗，多組間計量資料樣本均數(shù)比較采用單因素方差（ANOVA）分析；非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)及范圍表示，組間比較采用非參數(shù)檢驗。所有檢驗水準P值均為0.05。

2 結(jié)果

2.1 研究對象一般臨床基本特征

T1DM組與正常對照組在性別比例、體重指數(shù)（BMI）、收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。T1DM組年齡、空腹血糖（FBG）、餐后血糖（PBG）水平均高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）（表1）。

2.2 VDR基因Fok I多態(tài)性限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）分析

限制性內(nèi)切酶Fok I酶切VDR基因的PCR擴增產(chǎn)物后，進行瓊脂糖電泳，使用凝膠成像系統(tǒng)分析觀察條帶。FF型純合子不含F(xiàn)ok I酶識別位點，顯示為1條265 bp片段；ff型純合子具有Fok I酶識別位點，顯示為2條分別為69 bp和196 bp 的片段；雜合子Ff型的酶切產(chǎn)物則出現(xiàn)3個片段：69 bp、196 bp和265 bp（圖1）。

2.3 基因型及等位基因頻率的分布情況

T1DM和對照組的Fok I基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡。與對照組比較，T1DM組VDR基因Fok I基因型分布和等位基因頻率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）（表2）。

2.4 T1DM組VDR基因Fok I基因型與臨床指標的關(guān)系

比較T1DM中VDR基因Fok I各基因型患者間的臨床指標差異，結(jié)果顯示Ff基因型組與ff基因型組的空腹C-肽（FCP）、餐后C-肽（PCP）均低于FF基因型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）（表3）。

3 討論

目前VDR基因Fok I多態(tài)性與T1DM易感性的相關(guān)研究結(jié)果并不一致。這些研究包括來自希臘[4]、日本[5]、荷蘭[6]、南斯拉夫[7]、西班牙[8-9]、意大利[10]等國的研究。導(dǎo)致這些研究結(jié)果的不一致性的因素部分是由于有些研究的樣本數(shù)過??；出現(xiàn)較多陽性研究結(jié)果報道的可能解釋是出版偏倚[8]。本研究顯示VDR基因Fok I基因多態(tài)性與T1DM易感性不相關(guān)，研究結(jié)果與羅馬尼亞、芬蘭、挪威、美國、英國、土耳其、德國、葡萄牙等國家學(xué)者研究結(jié)果相同[3，11-15]。

T1DM是多基因遺傳病，其遺傳病因研究的標志物如其他多基因疾病中遺傳標志物一樣，由于不同研究對象來自不同的種族和地域，其結(jié)果往往不同[16]。例如，VDR基因Fok I多態(tài)性與西班牙人群T1DM易感性的關(guān)聯(lián)基因隨著西班牙地區(qū)地理位置不同而變化，在西班牙地中海地區(qū)，T1DM患者中轉(zhuǎn)錄活性更強的VDR Fok I FF基因型比例增加，而在西班牙納瓦拉區(qū)域的T1DM患者中則是轉(zhuǎn)錄活性較弱的ff基因型降低[8]。一項以3 000例芬蘭人作為觀察對象的較大樣本的病例對照研究發(fā)現(xiàn)，芬蘭人群中VDR基因Fok I SNPs與T1DM易感性不相關(guān)[13]。Nejentsev S等[12]的大樣本研究中納入對象來自不同地區(qū)和國家，該研究結(jié)果也否認了VDR基因Fok I基因多態(tài)性與T1DM易感性的關(guān)聯(lián)。但這些研究中T1DM患者可能包含了部分LADA患者，這使得研究人群的存在異質(zhì)性，可能是造成各研究結(jié)果不一致的一個原因。在本研究中，T1DM不包括LADA患者，因而本研究結(jié)果能夠更好的反映出T1DM患者VDR基因Fok I基因型特征。

本研究發(fā)現(xiàn)ff基因型組與Ff基因型組的FCP和PCP水平顯著低于FF基因型組，表明ff基因型組與Ff基因型組患者胰島細胞功能更差，提示VDR基因Fok I基因型可能與胰島素分泌相關(guān)，這個結(jié)果與Mory DB等[17]和Ogunkolade BW等[18]的研究相符。Mory DB等[17]研究發(fā)現(xiàn)Ff基因型和ff基因型患者殘存的胰島功能較FF基因型低；Ogunkolade BW等研究亦表明VDR基因型Fok I基因與胰島素分泌能力相關(guān)，VDR基因型是VDR mRNA和VDR蛋白水平的重要決定因素之一，F(xiàn)ok I多態(tài)性影響VDR mRNA水平。同時有研究發(fā)現(xiàn)VDR基因Fok I基因多態(tài)性可能干擾VDR異聚體與視黃酸X受體形成效應(yīng)復(fù)合物[19]，VDR ff基因型轉(zhuǎn)錄活性降低，VDR mRNA水平降低，引起胰島素分泌能力降低，C肽分泌減少。上述研究提示，T1DM患者中VDR ff基因型組與Ff基因型與胰島細胞功能負相關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示VDR基因Fok I多態(tài)性與T1DM遺傳易感性不相關(guān)；T1DM患者中ff基因型與Ff基因型的FCP和PCP水平顯著低于FF基因型患者，提示T1DM患者VDR基因Fok I基因型與胰島細胞功能相關(guān)。

[參考文獻]

[1]Bach JF. Insulin-dependent diabetes mellitus as an autoimmune disease[J]. Endocr Rev，1994，15（4）：516-542.

[2]Bhalla AK，Amento EP，Serog B，et al. 1，25-Dihydroxyvitamin D3 inhibits antigen-induced T cell activation[J]. J Immunol，1984，133（4）：1748-1754.

[3]Machael A，Pani MA，Knapp M，et al. Vitamin D receptor allele combinations influence genetic susceptibility to type 1 diabetes in Germans[J]. Diabetes，2000，49（3）：504-507.

[4]Panierakis C，Goulielmos G，Mamoulakis D，et al. Vitamin D receptor gene polymorphisms and susceptibility to type 1 diabetes in Crete，Greece[J]. Clin Immunol，2009，133（2）：276-281.

[5]Yokota I，Satomura S，Kitamura S，et al. Association between vitamin D receptor genotype and age of onset in juvenile Japanese patients with type 1 diabetes[J]. Diabetes Care，2002，25（7）：1244.

[6]Koeleman BP，Valdigem G，Eerligh P，et al. Seasonality of birth in patients with type 1 diabetes[J]. Lancet，2002，359（9313）：1246-1247.

[7]Zemunik T，Skrabic V，Boraska V，et al. Fok I polymorphism，vitamin D receptor，and interleukin-1 receptor haplotypes are associated with type 1 diabetes in the Dalmatian population[J]. J Mol Diagn，2005，7（5）：600-604.

[8]Audi L，Marti G，Esteban C，et al. VDR gene polymorphism at exon 2 start codon （Fok I） may have influenced Type 1 diabetes mellitus susceptibility in two Spanish populations[J]. Diabet Med，2004，21（4）：393-394.

[9]San-Pedro JI，Bilbao JR，Perez de Nanclares G，et al. Heterogeneity of vitamin D receptor gene association with celiac disease and type 1 diabetes mellitus[J]. Autoimmunity，2005，38（6）：439-444.

[10]Capoluongo E，Pitocco D，Concolino P，et al. Slight association between type 1 diabetes and "ff" VDR Fok I genotype in patients from the Italian Lazio Region. Lack of association with diabetes complications[J]. Clin Biochem，2006，39（9）：888-892.

[11]Guja C，Marshall S，Welsh K，et al. The study of CTLA-4 and vitamin D receptor polymorphisms in the Romanian type 1 diabetes population[J]. J Cell Mol Med，2002，6（1）：75-81.

[12]Nejentsev S，Cooper JD，Godfrey L，et al. Analysis of the vitamin D receptor gene sequence variants in type 1 diabetes[J]. Diabetes，2004，53（10）：2709-2712.

[13]Turpeinen H，Hermann R，Vaara S，et al. Vitamin D receptor polymorphisms： no association with type 1 diabetes in the Finnish population[J]. Eur J Endocrinol，2003，149（6）：591-596.

[14]Gogas Yavuz D，Keskin L，Klylcl S，et al. Vitamin D receptor gene BsmI，F(xiàn)okI，ApaI，TaqI polymorphisms and bone mineral density in a group of Turkish type 1 diabetic patients[J]. Acta Diabetol，2011，48（4）：329-336.

[15]Lemos MC，F(xiàn)agulha A，Coutinho E，et al. Lack of association of vitamin D receptor gene polymorphisms with susceptibility to type 1 diabetes mellitus in the Portuguese population[J]. Hum Immunol，2008，69（2）：134-138. [16]Guo SW，Magnuson VL，Schiller JJ，et al. Meta-analysis of vitamin D receptor polymorphisms and type 1 diabetes： a HuGE review of genetic association studies[J]. Am J Epidemiol，2006，164（8）：711-724.

[17]Mory DB，Rocco ER，Miranda WL，et al. Prevalence of vitamin D receptor gene polymorphisms FokI and BsmI in Brazilian individuals with type 1 diabetes and their relation to beta-cell autoimmunity and to remaining beta-cell function[J]. Hum Immunol，2009，70（6）：447-451. [18]Ogunkolade BW，Boucher BJ，Prahl JM，et al. Vitamin D receptor （VDR） mRNA and VDR protein levels in relation to vitamin D status，insulin secretory capacity，and VDR genotype in Bangladeshi Asians[J]. Diabetes，2002，51（7）：2294-2300.

[19]Haussler MR，Whitfield GK，Haussler CA，et al. The nuclear vitamin D receptor：biological and molecular regulatory properties revealed[J]. J Bone Miner Res，1998，3（3）：325-349.

（收稿日期：2012-07-04本文編輯：林利利）