紅毛五加提取物誘導卵巢癌細胞系OVCAR3凋亡

歐陽資章 龍啟才

[摘要] 目的 研究紅毛五加提取物的抗腫瘤活性。 方法 分別采用MTT法、形態(tài)學、流式細胞術方法檢測純氯仿洗脫部分對腫瘤細胞OVCAR3的生長抑制及促凋亡。 結果 MTT法可見氯仿洗脫部分對體外培養(yǎng)的卵巢上皮癌細胞OVCAR3的生長有抑制作用，高、低劑量組抑制率分別為20.6%、11.4%；形態(tài)學以及流式細胞術都可見氯仿洗脫部分可以促進OVCAR3凋亡。 結論 紅毛五加純氯仿洗脫部分對腫瘤細胞株OVCAR3細胞有促凋亡的作用。

[關鍵詞] 紅毛五加；凋亡；OVCAR3；卵巢癌

[中圖分類號] R-33[文獻標識碼] A[文章編號] 1674-4721（2012）07（c）-0010-03

Apoptosis of ovarian cancer cell lines OVCAR-3 induced by the extract Acanthopanax giraldii Harms

OUYANG Zizhang1 LONG Qicai2

1. The People′s Hospital of Qingyuan City in Guangdong Province, Qingyuan 511518, China; 2. College of Pharmacy, Sun Yat-sun University, Guangdong Province, Guangzhou 510006, China

[Abstract] Objective To investigate the anti-tumor activity of extract from Acanthopanax giraldii Harms. Methods Growth inhibition and promote apoptosis of cancer cell lines OVCAR3 by the chloroform eluting parts were measured by MTT method, morphological method and flow cytometry methods respectively. Results The chloroform eluting parts had the inhibitory action on the growth of ovarian cancer cell lines OVCAR-3 cultured in vitro. Inhibitory ratios of high and low dose group were 20.6% and 11.4% respectively. The chloroform eluting parts could inhance the apoptosis of OVCAR3 in morphological method and flow cytometry methods. Conclusion The chloroform eluting parts from Acanthopanax giraldii Harms has the effect to promote the apoptosis of cancer cell lines OVCAR3.

[Key words] Acanthopanax giraldii Harms; Apoptosis; OVCAR3; Ovarian cancer

紅毛五加為五加科植物，以莖皮入藥，性溫、味辛、入肝腎經(jīng)。具有祛風除濕，通關節(jié)、強筋骨之功效，主治風寒濕痹、足膝無力等癥[1]，現(xiàn)代藥理試驗證明紅毛五加多糖對體外培養(yǎng)胃癌細胞抑制作用[2]，能通過抑制原癌基因，激活抑癌基因和細胞因子，從而誘導胃癌細胞凋亡[3]，在抗腫瘤的同時對健康人細胞無影響[4]。紅毛五加莖皮揮發(fā)油成分對體外培養(yǎng)人白血病粒細胞有明顯抑制癌細胞生長效應，抑制率達90%[5]。COX-2在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中有重要作用，COX-2 通過旁分泌和自分泌直接地或通過上調(diào)芳香族酶的活性間接地促進腫瘤細胞的生長[6-8]。在前期的實驗中，筆者提取分離的紅毛五加正丁醇萃取部分經(jīng)氯仿洗脫部分能通過抑制COX-2，從而抑制炎癥因子PGE2產(chǎn)生，具有抑制炎癥反應的作用。在此文中，筆者以人卵巢上皮癌細胞 OVCAR3為模型細胞研究此部分提取分離物是否也具有抑制腫瘤細胞生長的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

紅毛五加由中山大學藥學院楊得坡教授鑒定為紅毛五加（Acanthopanax giraldii Harms.）的莖皮；紅毛五加提取物為紅毛五加正丁醇萃取部分經(jīng)氯仿洗脫部分；人卵巢上皮癌細胞OVCAR3（中山大學實驗動物中心細胞庫）；DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司，批號：1380549）；胎牛血清（杭州四季青公司，批號：080919）；Hoechst33258（美國Sigma公司，批號為：CE294011）；碘化嘧啶PI（美國Sigma公司，批號：247208120）；MTT（碧云天生物技術研究所，批號：080721）；塞來昔布（美國輝瑞公司，批號：639T）；實驗中所用甲醇、氯仿、石油醚、乙酸乙酯、乙醇等試劑均為分析純；CO2培養(yǎng)箱（德國 HERAEUS公司）；超凈工作臺（HEAL FORCE公司）；DMI4000B倒置顯微鏡（德國Leica公司）；Thermo 多功能酶標儀（美國 Thermo Fisher Scientific 公司）；流式細胞儀（美國 BD FACS Calibur）。

1.2 試驗方法

1.2.1 MTT法檢測純氯仿洗脫組分對OVCAR3細胞生長抑制作用取對數(shù)生長期OVCAR3細胞，以每孔10³個細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積為200 μL，將培養(yǎng)板放入CO₂孵箱，在37℃，5%CO2以及飽和條件下，培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入180 μL培養(yǎng)基，隨即按照試驗分組加入20μL試驗藥物，對照組加入20 μL培養(yǎng)基，使藥物達到相應的藥物濃度，孵育48 h，每孔加入MTT溶液（5 mg/L）20 μL，37℃繼續(xù)孵育4 h，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，PBS洗滌3次，每孔加入150 mL DMSO，振蕩10 min，使甲臜充分溶解，選擇490 nm波長，在酶標儀上測定各孔光吸收值，記錄結果。

1.2.2 形態(tài)學檢測純氯仿洗脫部分對OVCAR3細胞促凋亡作用取潔凈的蓋玻片于70%乙醇浸泡5 min，無菌超凈臺內(nèi)吹干，將蓋玻片置于6孔板內(nèi)，接種細胞10^-6，培養(yǎng)過夜，吸棄培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)基0.9 mL，加入藥物0.1 mL，使藥物達到試驗濃度，正常對照組加入培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，吸棄培養(yǎng)液，加入0.5 mL固定液，固定15 min，去固定液，用PBS洗滌2次，每次3 min，吸盡液體，加入0.5 mL Hoechst33258染色液，染色5 min，熒光顯微鏡照相。

1.2.3 流式細胞儀檢測純氯仿洗脫部分對OVCAR3細胞周期阻滯作用取對數(shù)生長期細胞，用0.25%胰蛋白酶消化用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成細胞懸液，以每孔10⁶個細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔體積為1 mL，培養(yǎng)過夜，吸棄培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)基0.9 mL，同時加入藥物0.1 mL，使藥物達到試驗濃度，正常對照組加入培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，調(diào)整待測細胞的密度為1×106個/mL，取1 mL細胞，1 000轉/min，4℃離心10 min，棄除上清液，加入1 mL冷的PBS，輕輕振搖使細胞懸浮，1 000 rpm 4℃離心10 min棄去上清液，重復步驟3，4兩次，將細胞重懸浮于200 μL結合緩沖液，加入5 μL的PI，輕輕混勻，避光室溫反應15 min，加入300 μL結合緩沖液，立即用流式細胞儀檢測。

1.3 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，抑制率以百分率表示，采用SPSS 17.0 for Windows軟件對數(shù)據(jù)進行兩獨立樣本資料t檢驗（抑制率以卡方檢驗），P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 純氯仿洗脫部分對癌細胞生長的抑制作用

正常對照組細胞24 h培養(yǎng)后的OD值為0.543±0.013，塞來昔布作用后的OD值為0.504±0.018，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05），氯仿洗脫部分40 mg/L作用后的OD值為0.511±0.010，10 mg/L作用后的OD值為0.528±0.010，氯仿洗脫部分兩個劑量組的OD值與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05），高、低劑量組的抑制率分別為20.6%、11.4%，見表1。

2.2 形態(tài)學結果

正常細胞多角型，核為橢圓型，核大，核質(zhì)均勻；細胞核濃縮，核形狀有長棒狀、環(huán)形、不規(guī)則形，且熒光增強為凋亡細胞。如圖1所示，正常對照組未見凋亡細胞，而塞來昔布組可見典型的凋亡細胞，且凋亡細胞數(shù)量較多。試驗藥物的高，低劑量組同樣可見典型的凋亡細胞。

2.3 流式結果

見圖2。如圖2所示，純氯仿洗脫部分高、低、以及陽性藥物劑量組都可以促進細胞凋亡，凋亡率分別為26.0%、15.0%、32.7%，與形態(tài)學結果基本一致。

3 討論

紅毛五加為五加科植物，來源廣泛，具有多種作用，如抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)人體免疫力等作用，以前的研究表明紅毛五加多糖具有抗腫瘤作用，但未見紅毛五加其他成分是否具有抗腫瘤作用研究。在前期的研究中，筆者對紅毛五加抗炎成分進行了初步篩選，并研究了其抗炎的作用機制與抑制COX-2有關。COX-2高表達與腫瘤有關，卵巢惡性腫瘤的發(fā)病率居女性生殖器官惡性腫瘤的前幾位。研究發(fā)現(xiàn)，COX-2 在卵巢腫瘤細胞中高表達，而在正常的卵巢上皮中不表達[9-11]，COX-2 的表達與卵巢癌的級別呈正相關[12]。既然COX-2與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關，通過調(diào)節(jié)COX-2 來防治腫瘤已成為當今腫瘤學研究的熱點之一。NSAIDs有可能通過抑制COX-2合成而抑制腫瘤血管生成起到抑制腫瘤的效果[13-15]。既然紅毛五加中的乙醇提取物中純氯仿洗脫液中含有抑制COX-2活性的成分，所以筆者設計了實驗探討純氯仿洗脫部分是否對卵巢腫瘤細胞的生長有抑制作用。筆者采用體外實驗的方法，分別用MTT法檢測了紅毛五加抗炎有效成分對OVCAR3細胞的毒性作用促凋亡作用，并以Hoechst染色法及流式細胞術測定法測定了紅毛五加中的乙醇提取物中純氯仿洗脫部分對OVCAR3細胞的促凋亡作用，結果初步證明了紅毛五加的抗腫瘤作用?？紤]到紅毛五加有效成分有抑制COX-2活性的作用，可以推測其促腫瘤細胞OVCAR3凋亡是通過抑制COX而實現(xiàn)的。當然本試驗只是初步的抗腫瘤試驗，而且是體外試驗，至于在體是否有抗腫瘤作用還需進一步的動物試驗以驗證。

總之，本實驗證明紅毛五加抗炎有效成分，即紅毛五加中的乙醇提取物中純氯仿洗脫部分對OVCAR3細胞有促凋亡的作用。

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（收稿日期：2012-06-05本文編輯：林利利）