同時(shí)培養(yǎng)法與吸附法微生物固定化對(duì)比

山 丹，馬 放，張 斯，王 晨，3

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)城市水資源與水環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，150090哈爾濱;2.中日友好環(huán)境保護(hù)中心，100029北京;3.中國(guó)國(guó)際工程咨詢公司，100044北京)

微生物固定化技術(shù)是指將微生物通過一定的技術(shù)手段(如利用載體材料、包埋物質(zhì)或合理控制水力條件等)保持在反應(yīng)器內(nèi).菌絲球是由霉菌的自絮凝現(xiàn)象產(chǎn)生的具有一定機(jī)械強(qiáng)度和大小的球體，它除了具有生物活性良好、沉降速度快、易于固液分離等優(yōu)點(diǎn)外，吸附和降解效能近來也被廣泛關(guān)注［1-4］.目前，國(guó)外主要注重對(duì)菌絲球基礎(chǔ)理論和結(jié)構(gòu)方面的研究，國(guó)內(nèi)的研究則大多是面向應(yīng)用的［5-7］.菌絲球在工業(yè)廢水處理方面的研究起步比較晚，目前還沒有實(shí)際應(yīng)用的例子，實(shí)驗(yàn)室研究也只涉及到對(duì)重金屬?gòu)U水和印染廢水的吸附［8-13］.應(yīng)用菌絲球作為載體是最新的研究方向，文獻(xiàn)［14］以曲霉形成的菌絲球吸附并固定產(chǎn)氫細(xì)菌——產(chǎn)酸克雷伯氏菌進(jìn)行連續(xù)流產(chǎn)氫，解決了產(chǎn)氫菌流失和產(chǎn)氫速率降低的問題，實(shí)現(xiàn)了霉菌和功能菌的生態(tài)位分離，將各自的功能有機(jī)地結(jié)合到了一起.但是，考慮到采用吸附法向菌絲球上固定化微生物的方法操作步驟繁瑣、耗時(shí)、固定微生物量有限、形成的混合菌絲球內(nèi)部微生物分布不均勻，勢(shì)必影響固定化微生物的活性和整個(gè)球體的傳質(zhì)效果.本實(shí)驗(yàn)為菌絲球這種新型生物質(zhì)載體提出了一種新的固定化方法——同時(shí)培養(yǎng)法，并以高效低溫苯胺降解細(xì)菌JH-9作為研究對(duì)象，對(duì)同時(shí)培養(yǎng)和吸附兩種固定化方法作了對(duì)比研究，為混合菌絲球的實(shí)際應(yīng)用提供了有力的理論基礎(chǔ).

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 儀器和試劑

用于本試驗(yàn)的設(shè)備主要為8037—SGS超型全自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器、ZHWY—2112B型雙層全溫度恒溫振蕩器、紫外分光光度儀(UNICAMHEλIOS)、CX31型顯微鏡、電子天平(ALC-210.4)、顯微數(shù)碼成像系統(tǒng)、垂直流超凈工作臺(tái)、鼓風(fēng)干燥箱、石蠟切片機(jī).

1.1.2 菌種來源

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 單純霉菌菌絲球的培養(yǎng)

配置液體培養(yǎng)基，121℃，滅菌20 min，接種孢子懸液，于160 r/min、37℃的搖床中培養(yǎng)24 h.

1)菌絲球生長(zhǎng)培養(yǎng)基成分.蔗糖30 g，NH4Cl 0.5 g，K2HPO3·H2O 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g，H2O 1 000 mL.

2)孢子懸液的配置.用無菌的生理鹽水沖洗長(zhǎng)有曲霉菌的斜面固體培養(yǎng)基的表面，用接種環(huán)輕刮斜面，直至菌體被完全沖洗下來.輕輕震蕩試管，使懸液中的孢子呈均勻分散狀態(tài).用可見分光光度計(jì)在波長(zhǎng)620 nm下測(cè)其吸光度(A)．

3)菌絲碎片的制備.用量筒取球齡4 d的菌絲球，靜置30 min.使菌絲球充分沉降，量取量筒底部沉降下來的菌絲球150 mL，用無菌水稀釋至300 mL倒入粉碎機(jī)中1 800 r/min，粉碎30 s，制成混合均勻的菌絲片段懸液.

1.2.2 混合菌絲球培養(yǎng)方案

取低溫條件下的JH-9培養(yǎng)液在12 000 r/min下離心5 min，然后棄離心上清液，用磷酸鹽緩沖溶液清洗離心管底部的菌體，在上述條件下再次離心，如此操作兩次.洗菌后將離心管底部的菌體取出，用適量無菌水配成均勻菌懸液.按照菌絲球片段繁殖和孢子繁殖這兩種不同的繁殖方法，分別采取同時(shí)和先后接種的方法培養(yǎng)混合菌絲球，并以不接種JH-9細(xì)菌的單純菌絲球作為對(duì)照(具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案見表1).

煤全部燒光了；煤桶空了；煤鏟也沒有用了；火爐里透出寒氣，灌得滿屋冰涼。窗外的樹木呆立在嚴(yán)霜中；天空成了一面銀灰色的盾牌，擋住向蒼天求助的人。我得弄些煤來燒；我可不能活活凍死；我的背后是冷酷的火爐，我的面前是同樣冷酷的天空，因此我必須快馬加鞭，在它們之間奔馳，在它們之間向煤店老板要求幫助。

表1 混和菌絲球培養(yǎng)方案

1.2.3 菌絲球直徑的測(cè)定

隨機(jī)選取10個(gè)菌絲球，用濾紙吸去菌絲球外表面水分.吸取的水分應(yīng)適量，保證菌絲球不因失去過多水分而變形.然后以游標(biāo)卡尺量取直徑數(shù)值.菌絲球直徑表示為10個(gè)菌絲球直徑的平均值.

1.2.4 成球堆積體積測(cè)定方法

將250 mL三角瓶中的菌絲球培養(yǎng)液倒入一個(gè)200 mL量筒中，靜置10 min，讀取菌絲球沉降體積作為成球堆積體積.

1.2.5 菌絲球形態(tài)觀察

將接種后的液體培養(yǎng)基置于160 r/min，37℃搖床培養(yǎng)，當(dāng)菌絲球培養(yǎng)到直徑1～2 cm時(shí)，將菌絲球接入培養(yǎng)皿中用數(shù)碼照相機(jī)拍照觀察外觀形態(tài)，而后將菌絲球切開用掃描電子顯微鏡觀察其微觀菌絲形態(tài)和混合菌絲球生態(tài)構(gòu)成.

1.3 實(shí)驗(yàn)過程

1.3.1 不同固定化方法對(duì)混合球成球速度的影響

將霉菌Y3和菌株JH-9分別以同時(shí)接種培養(yǎng)(向培養(yǎng)液中同時(shí)接種Y3和JH-9)和吸附法培養(yǎng)(在培養(yǎng)液中先接種Y3待培養(yǎng)48 h菌絲球形成時(shí)向培養(yǎng)液中接種JH-9)的方式形成混合菌絲球，兩種接種方式中霉菌Y3初始的接種量相等，而工程菌JH-9的初始接種量分別為5、10、20 mL(母液細(xì)菌量1.2×109/mL).每隔8 h測(cè)定培養(yǎng)液的吸光度A．

1.3.2 不同固定化方法對(duì)混合菌絲球成球堆積體積的影響

按照1.3.1中所述的兩種方法進(jìn)行固定化，培養(yǎng)混合菌絲球.當(dāng)培養(yǎng)液的吸光度值A(chǔ)降為0時(shí)，將培養(yǎng)液中混合菌絲球移至量筒，靜止沉降30 min后測(cè)量全部菌絲球堆積體積，本實(shí)驗(yàn)以單純霉菌菌絲球作對(duì)照.

1.3.3 不同培養(yǎng)方法對(duì)混合菌絲球成球大小的影響

按照1.3.1所述的兩種方法進(jìn)行固定化，培養(yǎng)混合菌絲球.當(dāng)培養(yǎng)液的吸光度值A(chǔ)降為0時(shí)，隨機(jī)各取不同固定化方法形成的混合菌絲球10個(gè)，分別測(cè)量其直徑d的大小，取其平均值作為菌絲球的大小(這里所指成球大小即菌絲球的直徑d)．

1.3.4 不同培養(yǎng)法對(duì)混合菌絲球總質(zhì)量和相對(duì)密度的影響

按照1.3.1中所述的兩種方法進(jìn)行固定化，培養(yǎng)混合菌絲球.當(dāng)培養(yǎng)液的吸光度值A(chǔ)降為0時(shí)，將不同固定化方法形成的全部混合菌絲球從三角瓶中取出，去除多余水分(吸取量控制在不使菌絲球變形為宜)后放至已恒重的蒸發(fā)皿中，置于烘箱，95℃烘干至恒質(zhì)量，讀取皿和球的總質(zhì)量，去掉空皿質(zhì)量得到混合菌絲球的總質(zhì)量.成球總相對(duì)密度定義為成球總質(zhì)量除以成球堆積體積.

1.3.5 混合菌絲球內(nèi)部形態(tài)觀察

采用同時(shí)培養(yǎng)法和吸附法培養(yǎng)混合菌絲球，隨機(jī)取兩種混合菌絲球各1個(gè)，切開后在掃描電子顯微鏡下觀察其內(nèi)部形態(tài)結(jié)構(gòu)，同時(shí)以沒有固定化細(xì)菌的單純霉菌菌絲球內(nèi)部形態(tài)結(jié)構(gòu)作對(duì)比.

2 結(jié)果分析

2.1 不同固定化方法對(duì)混合菌絲球成球速度的影響

將霉菌Y3和功能菌JH-9分別以同時(shí)培養(yǎng)(向培養(yǎng)液中同時(shí)接種Y3和JH-9)和吸附法培養(yǎng)(在培養(yǎng)液中先接種Y3待培養(yǎng)48 h菌絲球形成時(shí)向培養(yǎng)液中接種JH-9)的方式形成菌絲球，兩種接種方式中霉菌Y3初始的接種量相等，而功能菌JH-9的初始接種量分別為5、10、20 mL(母液細(xì)菌量1.2×109/mL).每隔8 h測(cè)定培養(yǎng)液的吸光度A．如圖1、2所示，不論同時(shí)培養(yǎng)法還是吸附法，培養(yǎng)液的吸光度值自接種時(shí)起一直持續(xù)降低，最后降為0.不同接種量的同時(shí)培養(yǎng)法培養(yǎng)液吸光度值都在72 h降為0.而吸附法只有接種5 mL菌液的培養(yǎng)液在培養(yǎng)72 h時(shí)吸光度值降為0.同時(shí)培養(yǎng)法固定化細(xì)菌的時(shí)間比先后接種法要短.將培養(yǎng)液吸光度降為0視為混合菌絲球成球完全，以單位時(shí)間內(nèi)培養(yǎng)液吸光度值A(chǔ)減少量V來表示混合菌絲球的成球速度，將以上數(shù)據(jù)重新整理，以混合菌絲球成球速度成圖，結(jié)果如圖3所示.

圖1 同時(shí)培養(yǎng)法不同接種量對(duì)成球的影響

圖2 吸附法不同接種量對(duì)成球的影響

圖3 不同固定化方法對(duì)混合菌絲球成球速度的影響

由圖3可以看出，隨著JH-9接種量的增加混合菌絲球的成球速度逐漸提高，即霉菌數(shù)量一定時(shí)，混合菌絲球的成球速度與功能菌的接種量成正比.JH-9接種5 mL時(shí)，同時(shí)培養(yǎng)法成球速度小于先后接種培養(yǎng)法;JH-9接種10 mL時(shí)，同時(shí)培養(yǎng)法與吸附法成球速度基本相等;JH-9接種20 mL時(shí)，同時(shí)培養(yǎng)法成球速度明顯大于吸附法.這說明在相同的培養(yǎng)條件下同時(shí)培養(yǎng)法能夠以更快的速度固定化更多的細(xì)菌，其單位時(shí)間內(nèi)固定化細(xì)菌量更多.

2.2 不同固定化方法對(duì)混合菌絲球成球堆積體積的影響

當(dāng)培養(yǎng)液吸光度降為0以后，將培養(yǎng)液中混合菌絲球取出以量筒測(cè)量全部菌絲球堆積體積，以單純霉菌菌絲球作對(duì)照，結(jié)果如圖4所示.可以看出，隨著JH-9接菌量的增多，最終形成混合菌絲球的體積也增多，即混合菌絲球的堆積體積與功能菌的接種量成正比.同時(shí)培養(yǎng)法比吸附法所形成的混合菌絲球堆積體積略大一些.

2.3 不同固定化方法對(duì)混合菌絲球成球大小的影響

隨機(jī)各取不同固定化方法形成的混合菌絲球10個(gè)，分別測(cè)量其直徑大小，再取平均值作為菌絲球的平均大小.不同固定化方法形成的混合菌絲球成球大小如圖5所示，可以看出，相同接種量的條件下，同時(shí)培養(yǎng)法形成的混合菌絲球直徑比吸附法的小，且成球總數(shù)量多.接種方法相同時(shí)，混合菌絲球的大小隨著接種細(xì)菌數(shù)量的增多而變大.

圖4 不同固定化方法對(duì)混合菌絲球成球堆積體積的影響

圖5 不同固定化方法對(duì)混合菌絲球成球大小的影響

2.4 不同固定化方法對(duì)混合菌絲球總質(zhì)量和總相對(duì)密度的影響

將不同固定化方法形成的全部混合菌絲球從三角瓶中取出，盡量去除多余水分后放到已經(jīng)恒重的蒸發(fā)皿中，吸取量控制在不使菌絲球變形為宜，將處理好的菌球置于烘箱內(nèi)，95℃烘干至恒質(zhì)量，讀取皿和球的總質(zhì)量，去掉空皿質(zhì)量得到混合菌絲球的總質(zhì)量.以成球總質(zhì)量除以成球堆積體積即定義為成球總相對(duì)密度.

由圖6可以看出，當(dāng)細(xì)菌接種量相同時(shí)，同時(shí)培養(yǎng)法形成的混合菌絲球的總質(zhì)量和總相對(duì)密度都要小于吸附法形成的混合菌絲球;而相同固定化方法，隨著細(xì)菌接種量的增加形成混合菌絲球的總質(zhì)量和總相對(duì)密度卻減少.

圖6 不同固定化方法對(duì)混合菌絲球成球總質(zhì)量和密度的影響

2.5 不同固定化方法對(duì)混合菌絲球內(nèi)部形態(tài)的影響

分別采用同時(shí)培養(yǎng)法和吸附法培養(yǎng)混合菌絲球，隨機(jī)取兩種混合菌絲球各1個(gè)，切開后在掃描電子顯微鏡下觀察其內(nèi)部形態(tài)結(jié)構(gòu)，同時(shí)以沒有固定化細(xì)菌的單純霉菌菌絲球內(nèi)部形態(tài)結(jié)構(gòu)作對(duì)比，結(jié)果如圖7所示.可以看出:圖7(a)中采用吸附固定化方法形成的混合菌絲球內(nèi)部的細(xì)菌只固著在菌絲交叉形成平臺(tái)的地方，而在沒有交叉的菌絲上就沒有細(xì)菌存在;而圖7(c)中采用同時(shí)培養(yǎng)固定化方法形成的混合菌絲球內(nèi)部，細(xì)菌是非常均勻地排列生長(zhǎng)在每一根菌絲上，無論菌絲交聯(lián)與否，而且單位面積上固定化生長(zhǎng)的細(xì)菌數(shù)量也明顯多于圖7(a)的混合菌絲球.而且，圖7(c)中細(xì)菌均勻排列，很少出現(xiàn)堆積和分層的現(xiàn)象，不影響菌絲球內(nèi)部的能量和氧的供給，不會(huì)影響菌絲球?qū)?nèi)部細(xì)菌的傳質(zhì)，這樣被固定的細(xì)菌就能夠保持較高的活性，更有利于在水處理工藝中的應(yīng)用.

圖7 不同固定化方法形成的混合菌絲球內(nèi)部形態(tài)結(jié)構(gòu)的掃描電子顯微鏡照片

3 結(jié)論

1)相同接種量的條件下，同時(shí)培養(yǎng)法固定化細(xì)菌所用的固定化時(shí)間縮短，而且在單位時(shí)間內(nèi)可固定化細(xì)菌量更多.同時(shí)培養(yǎng)法與吸附法所形成的混合菌絲球相比，其堆積體積更大，成球總數(shù)量更多，球體直徑較小，總質(zhì)量和總相對(duì)密度也較小.

2)當(dāng)采用同一種固定化方法時(shí)，混合菌絲球的堆積體積、成球大小與功能菌的接種量成正比;而形成混合菌絲球的總質(zhì)量和總相對(duì)密度卻與功能菌的接種量成反比.

3)同時(shí)培養(yǎng)法形成的混合菌絲球內(nèi)部細(xì)菌非常均勻地排列生長(zhǎng)在每一根菌絲上，無論菌絲交聯(lián)與否;而吸附法形成的混合菌絲球內(nèi)部，細(xì)菌只存在于多條菌絲交叉形成平臺(tái)的地方.所以，新型微生物固定化方法可能會(huì)有效解決傳統(tǒng)方法的傳質(zhì)效率低、固定生物量低、成本高等問題，具有較大的開發(fā)潛力和應(yīng)用價(jià)值.

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