重疊PCR法構(gòu)建人心房肌SK2(KCNN2)基因表達質(zhì)粒及鑒定和序列分析*

譚曉秋,陳桂蘭,李 濤,毛 亮,井上勛,楊 艷,曾曉榮

(瀘州醫(yī)學院醫(yī)學電生理省部共建教育部重點實驗室,四川瀘州 646000)

近年來,小電導鈣激活鉀通道(small conductance calcium activated potassium channels,SK2)在人心房肌細胞上發(fā)現(xiàn)并證明在心肌細胞復極化過程中扮演著重要角色[1]。SK2通道在心房與心室表達的不均一性以及與胞內(nèi)鈣離子和細胞膜鈣通道的耦聯(lián)關系提示在某些房性心律失常(如心房顫動等)發(fā)生發(fā)展中起重要作用,也可能成為這些疾病的治療靶點[2-4]。異源表達離子通道在工具細胞如HEK293等,已成為目前研究離子通道功能活動和藥物篩選的主要方法之一。因直接進行RT-PCR無法得到該基因(KCNN2)的編碼區(qū)全長序列,本研究旨在采用Overlapping PCR(重疊PCR)法進行KCNN2基因全長序列的擴增和表達質(zhì)粒的構(gòu)建。

1 材料與方法

1.1 實驗標本、試劑和儀器

用于本研究的實驗標本來源于一例先天性心臟病患者體外循環(huán)手術常規(guī)切除的右心耳組織。主要試劑包括總RNA提取試劑盒(上海華舜公司)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒與SYBR Green I定量試劑盒(TOYOBO公司)、膠回收試劑盒(北京天根公司)、質(zhì)粒提取試劑盒、pMD18-T載體、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)、5-溴-4 氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-a-D-galactopyranoside,X-gal,TAKARA公司),焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate,DEPC)、LB培養(yǎng)基(上海生工公司),大腸桿菌DH5α本實驗室自己保存,其余試劑為國產(chǎn)分析純。主要實驗儀器有實時熒光定量PCR儀(MJ公司)、紫外分光光度儀(Nanodrop公司)、超速低溫離心機(Heraeus公司)、Millipore超純水儀(Millipore公司)等。

1.2 總RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄

進行人心房肌總 RNA提取,得到的總 RNA-80℃保存?zhèn)溆?。取總RNA約1.5 μ g,構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄反應體系 :Total RNA 1.5 μ g 、ReverTra Ace 1 μ l、5 ×RT Buffer 4 μ l、dNTP Mixture 2 μ l、RNase Inhibitor 1 μ l、Random Primer 1 μ l、RNase Free H2O up to 20 μ l。獲得的cDNA-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 Overlapping法擴增SK2編碼區(qū)全長

采用Overlapping PCR方法(引物見表1,方法見圖1)進行PCR擴增,得到小電導鈣激活鉀通道編碼基因KCNN2編碼區(qū)全長。首先以cDNA為模板,分別使用三對不同的引物,根據(jù)其自身的條件進行PCR,擴增得到三個不同的KCNN2基因片段,長度分別為775 bp,691 bp,715 bp。然后將含有三個不同片段的DNA作為模板,使用擴增第一個片段的上游引物和擴增第三個片段的下游引物,作為反應的引物進行PCR擴增,產(chǎn)物經(jīng)過1%的瓊脂糖凝膠電泳和膠回收,得到KCNN2基因編碼區(qū)的全長序列。為保證終止效果,在第三段擴增的過程中,我們在原有終止子UAG的基礎上再增加一個終止子UAG。

1.4 表達質(zhì)粒pIRES-hrGFP-SK2的構(gòu)建

將擴增得到的KCNN2基因編碼區(qū)的全長序列通過T-A克隆的與克隆載體pMD18-T Vector進行連接和轉(zhuǎn)化反應。在含有X-gal、IPTG、Amp的 L-瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng),形成單菌落。進行藍白篩選,提取陽性菌落質(zhì)粒,得到的重組質(zhì)粒標準品經(jīng)PCR法和酶切法鑒定。

由于得到的KCNN2基因全長和表達質(zhì)粒pIRES-hrGFP均含有Bam HI和Eco RI限制性內(nèi)切酶位點,并且方向一致,不會影響KCNN2基因的表達。將含有KCNN2基因全長序列的克隆載體pMD18-T Vector與表達質(zhì)粒pIRES-hrGFP進行分別的雙酶切反應并進行1%的瓊脂糖凝膠電泳和膠回收,選擇KCNN2基因全長片段和表達質(zhì)粒pIRES-hrGFP片段進行T4連接反應,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細菌DH5α中,提取質(zhì)粒,通過酶切法和測序法鑒定表達質(zhì)粒pIRES-hrGFP-SK2,選取序列正確的質(zhì)粒和菌液保存?zhèn)溆谩?/p>

Tab.1 Primer of gene KCNN2 for Overlapping PCR

Fig.1 Schematic diagram of Overlapping PCR for amplifying the full-length of KCNN2

2 結(jié)果

2.1 Overlapping PCR結(jié)果

以cDNA為模板,分段擴增KCNN2基因的電泳結(jié)果如圖2A所示,三個片段的位置與預測值基本一致。目的條帶單一清晰,且沒有明顯拖尾和引物二聚體產(chǎn)生。

在此基礎上,以三個目的片段的混合DNA為模板,以第一對引物的上游和第三對引物的下游作為引物進行Overlapping PCR擴增,得到的產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳如圖2B所示,可見一比1500 bp略大的清晰單一條帶,我們推測是KCNN2基因全長,這在后續(xù)實驗中得到了證實。

2.2 表達質(zhì)粒pIRES-hrGFP-SK2酶切鑒定和序列分析

將構(gòu)建的表達質(zhì)粒pIRES-hrGFP-SK2經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切反應并經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果如圖3所示?？梢妰蓷l單一的電泳條帶,其中分子量較小的條帶位置與KCNN2基因全長大小基本一致,分子量較大的條帶則為經(jīng)過雙酶切之后的表達質(zhì)粒pIRES-hrGFP片段。

將得到的表達質(zhì)粒經(jīng)測序,結(jié)果如圖4所示與Genebank數(shù)據(jù)庫人心肌KCNN2基因相比較,第531位氨基酸由精氨酸(CGG)變成了谷氨酰胺(CAG)。但是這一位點與腦中KCNN2基因序列一致。但與腦中KCNN2序列相比,腦組織中整個KCNN2基因全長序列為1740 bp,51至59九個丙氨酸殘基位置在腦中僅有8個丙氨酸殘基,比心肌KCNN2基因正好少三個堿基。

Fig.2 Electrophotogram of Overlapping PCR amplifier

Fig.3 Electrophotogram of the expression plasmid pIRES-hrGFPSK2 cutted by the enzymes Bam HI and Eco RI

3 討論

3.1 Overlapping PCR的原理和應用

Fig.4 Sequencing results of the plasmid pIRES-hrGFP-SK2

Overlapping PCR(重疊PCR)技術是采用具有互補末端的引物,使PCR產(chǎn)物形成重疊鏈,從而在隨后的擴增反應中通過重疊鏈的延伸,將不同來源的擴增片段連接起來,在體外進行有效的重組,而且不需要內(nèi)切酶消化和連接酶處理。目前重疊PCR應用十分廣泛[5]。而對于長片段基因擴增,多利用cDNA文庫,限制性酶切位點,降落PCR,5'或3'末端PCR等方法,但這些方法具有PCR條件難以摸索、不易找到合適酶切位點和cDNA文庫昂貴的缺點。因此,本研究探討分段擴增重疊PCR的方法進行。

重疊PCR能成功的關鍵是重疊的部分能保證有效的退火。所以重疊的部分要有一定長度,并且注意這部分的GC含量,以便使這部分有一個合適的Tm值。本實驗中,兩個重疊片段的GC含量分別為49.1%和44.9%。

3.2 Overlapping PCR在本研究中的應用和序列分析

本研究采用重疊PCR的原因在于目的基因片段較長(1743 bp)和表達量相對較低,曾試圖使用一步法PCR和降落PCR,但是通過多次摸索實驗條件,均無法得到該目的基因的全長序列。再則,由于需要得到目的基因編碼區(qū)全長,因此引物設計上極易受到限制,無法得到較好的引物對。于是通過分段擴增的方法,一方面,PCR片段減小,擴增更為容易;另外一個重要的原因就是與直接擴增相比,引物設計的自由度更大。結(jié)果表明,該方法較為容易的得到了SK2通道基因編碼區(qū)全長序列,成功構(gòu)建SK2通道基因表達質(zhì)粒,為進一步研究SK2通道特性及其調(diào)控鑒定了基礎。由于要進行多次PCR,因此,為保證反應的保真性,我們采取使用高保真的DNA反應聚合酶和減少PCR反應的循環(huán)數(shù)(20～25循環(huán))。

在得到的質(zhì)粒測序鑒定過程中,我們發(fā)現(xiàn),58位氨基酸堿基序列和531位氨基酸堿基序列表現(xiàn)出不同的特點。其中58位氨基酸在人腦組織中的氨基酸序列中并不存在,但是與已報道的人心房肌組織的氨基酸和堿基序列一致,也就是說編碼人腦組織中的SK2通道為579個氨基酸殘基(1740 bp),而心肌組織為580個氨基酸殘基(1743 bp)[1]。然而,在531位氨基酸上,我們的測序結(jié)果與腦組織的序列一致,為谷氨酰胺(CAG),文獻報道的心肌組織該位點則為精氨酸殘基(CGG)。究其原因主要有以下幾種可能:首先,SK2通道存在不同的剪變體,在心肌組織中存在文獻報道的心肌組織和腦組織的不同剪變體形式,由于我們采用分段擴增的方法,可能將兩個不同剪變體擴增而產(chǎn)生,或者是人心肌組織中就存在這種剪變體;其次,由于我們的實驗標本是來源一個病例標本,所以這也有可能是由于這個病例的個性產(chǎn)生的,由于離子通道高度的保守型,因而發(fā)生變異的可能性較小,但不能排除;再次,PCR擴增反應中突變產(chǎn)生,由于我們采用高保真的PCR反應酶,同時進行重復測序,因此這種可能性相對較少。由于這兩個位點處于通道的兩端,并非構(gòu)成離子通道的主要功能單位,對通道結(jié)構(gòu)功能影響很小,這在后續(xù)的離子通道電流檢測中得到了證實。因此,本實驗得到的SK2通道基因表達質(zhì)粒可以用于進一步的功能調(diào)控實驗研究。

[1]Xu Y,Tuteja D,Zhang Z,et al.Molecular identification and functional roles of a Ca2+-activated K+channel in human and mouse hearts[J].J Biol Chem,2003,278(49):49085-49094.

[2]Tuteja D,Xu D,Timofeyev V,et al.Differential expression of small-conductance Ca2+-activated K+channels SK1,SK2,and SK3 in mouse atrial and ventricular myocytes[J].AmJ Physiol Heart Circ Physiol,2005,289(6):H2714-2723.

[3]Li N,Timofeyev V,Tuteja D,et al.Ablation of a Ca2+-activated K+channel(SK2 channel)results in action potential prolongation in atrial myocytes and atrial fibrillation[J].J Physiol,2009,587(pt 5):1087-1100.

[4]Lu L,Zhang Q,Timofeyev V,et al.Molecular coupling of a Ca2+-activated K+channel to L-type Ca2+channelsviaalpha-actinin2[J].Circ Res,2007,100(1):112-120.

[5]戴 燦,苗聰秀,盧光王秀.基于重疊延伸PCR法的定點突變技術[J].現(xiàn)代生物學醫(yī)學進展,2010,10(3):411-412.