黃芩素純度標準物質的定值及其不確定度評定*

姚換方，全燦，劉軍，侯彩霞

(1.河北聯(lián)合大學化學工程學院，河北唐山 063009； 2.中國計量科學研究院化學計量與分析科學研究所，北京 100013)

黃芩素是黃芩的主要活性成分，具有增強免疫、抗炎和抗焦慮等藥理作用，被應用于醫(yī)藥、保健品及食品等領域[1-6],準確測定黃芩素的純度對相關產(chǎn)品的質量監(jiān)控具有重要意義。由于黃芩素受光照和pH等條件影響，穩(wěn)定性較差，同時從中藥材中提取分離純化制備標準物質成本較高[7-8]，當前未見國內外有關黃芩素純度標準物質的報道。

目前黃芩素的主要測定方法是高效液色譜法[9-10]。筆者通過高效液相色譜法(HPLC)和定量核磁技術(QNMR)對黃芩素標準物質進行純度定值。黃芩素的分子結構如圖1所示。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

傅里葉變換紅外光譜儀：THRMO NICOLET IS10型，美國熱電公司；

液相色譜-三級串聯(lián)四極桿質譜儀：6410型，美國Agilent公司；

圖1 黃芩素的分子結構

高效液相色譜儀：1100型，美國Agilent公司；

核磁共振儀：AV600型(BBI探頭)，德國布魯克公司；

卡爾費休庫侖法水分測定儀：DL-39型，瑞士梅特勒公司；

溴化鉀：光譜純，北京博德恒悅科貿有限公司；

氘代二甲亞砜：99.9%，美國Cambridge Laboratoties(CIL)公司；

苯甲酸：99.9%，國家一級標準物質，中國計量科學研究院；

色譜純乙腈：99.9%，美國Fisher Scientific公司；

色譜純甲醇：99.9%，德國Merck公司；

卡爾費休試劑：HYDRANAL?-Coulomat AG-H型，德國Riedel-deHaen公司；

超純水：電阻率為18.2 MΩ·cm，美國Milli-Q超純水機制備。

1.2 標準物質的制備

黃芩素純度標準物質原料通過定性分析確定主體成分，經(jīng)過初步定量分析篩選使之滿足純度、均勻性初檢要求后，將原料分裝到清洗干燥過的棕色玻璃瓶中，經(jīng)氮吹后，用真空包裝密封儲存，冷藏于4℃冰箱中。

1.3 定性分析

1.3.1 質譜分析

將樣品配成約為10 μg／mL的甲醇溶液進行質譜分析。采用正離子模式掃描。質譜條件：氣體溫度350℃；氣體流速9 L／min；噴霧器壓力275.8 kPa；毛細管電壓4000 V；質量范圍：m／z60～300。

1.3.2 紅外光譜分析

取樣品約1 mg與已干燥的100 mg溴化鉀混合均勻，壓片，進行紅外光譜測量。紅外光譜實驗條件：掃描范圍為400～4000 cm-1；背景掃描(采樣前采集背景)為16；分辨率為4；采樣增益為4。

1.4 純度定值分析

1.4.1 高效液相色譜(HPLC)分析

HPLC 條件：ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(460 mm×250 mm，5μm，美國 Agilent 公司 )；乙腈-0.1%磷酸水溶液(體積比為35∶65)為流動相；檢測波長為 260，265，275，280 nm，定值波長為275 nm；柱溫為30℃；流速為1 mL／min，樣品濃度為0.5 mg／mL。

1.4.2 定量核磁技術(QNMR)分析

QNMR條件：探頭溫度為25℃；譜寬為8012.82 Hz；脈沖寬度為4.2 μs，脈沖延遲時間為32 s；掃描次數(shù)為16次。

1.5 雜質分析

雜質分析主要包括水分和無機元素分析。

水分分析：采用卡爾費休庫侖滴定-直接進樣法進行水分的測定。實驗條件：混合時間為35 s；攪拌速度：40%。

無機元素分析：將樣品配成為0.1 mg/mL的甲醇溶液。利用電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)測定 Li，Be，B，Na，Mg，Al，Si等無機元素的含量。

1.6 樣品均勻性檢驗和穩(wěn)定性考察

根據(jù)JJF 1006-1994[11]的要求對黃芩素純度標準物質進行了均勻性檢驗。從黃芩素純度標準物質中隨機抽取15個包裝進行瓶間均勻性檢驗；任意選一瓶取7個子樣，進行瓶內均勻性檢驗。對HPLC法的測量數(shù)據(jù)進行F檢驗和t檢驗。

黃芩素純度標準物質穩(wěn)定性考察按先密后疏的原則，用HPLC法檢測在規(guī)定條件下保存的標準物質純度隨時間的變化情況。通常情況下，分別在第1，3，6個月進行穩(wěn)定性監(jiān)測。每次取5個包裝，每個包裝取一個子樣，測3次，計算平均值，將5個包裝測量結果的平均值作為檢測結果。若檢測結果的變動在定值結果不確定度范圍內，說明其穩(wěn)定。

2 結果與討論

2.1 定性分析

2.1.1 質譜分析

黃芩素的一級和二級質譜圖分別見圖2、圖3。

圖2 黃芩素的ESI-MS質譜圖

圖3 黃芩素的ESI-MS2質譜圖

通過一級質譜圖得到準分子離子峰[M+H]+m／z271約等于黃芩素的相對分子質量(270.24)加上氫的相對原子質量(1.0)。在二級質譜掃描中黃芩素主要發(fā)生兩種裂解方式：一種是[M+H]+通過C環(huán)中1，2位C—O鍵和3，4位C—C鍵(RDA裂解)發(fā)生斷裂得到碎片離子m／z169，m／z103，A環(huán)再進一步失去H2O，CO中性小分子碎片得到碎片離子m／z123，m／z95；另一種[M+H]+通過A環(huán)上脫去H2O，C2H2O中性分子碎片得到碎片離子m／z253和m／z211。根據(jù)黃酮類化合物的裂解規(guī)律，其中碎片離子m／z169比黃酮[A+H]+的m／z121多48，表明只含有酚羥基，碎片離子m／z103與黃酮[B1+H]+的質核比相同，表明B環(huán)中無取代基。

2.1.2 紅外光譜分析

由紅外光譜圖 4 可知，3410 cm-1(6，7 位，νOH)，3090 cm-1(5 位，νOH)，1660 cm-1(νC=O)，1618，1586和1505 cm-1(黃芩素苯環(huán)骨架的νC=C)與文獻報道[12]一致。

圖4 黃芩素紅外光譜圖

2.2 純度定值分析

2.2.1 高效液相色譜(HPLC)法分析

在波長為 260，265，275，280 nm 處進行檢測，發(fā)現(xiàn)黃芩素和雜質在275 nm處響應值較大，因此定值波長選為275 nm。黃芩素含有多個酚羥基，具有弱酸性，容易在溶液中電離，造成峰形拖尾和不尖銳等問題，加酸可以抑制其電離，使它呈分子狀態(tài)存在[13-14]，因此本實驗在流動相中加入了少量的磷酸。

圖5 黃芩素在275 nm波長下純度定值HPLC圖

2.2.2 QNMR法分析

通過脈沖延遲時間、掃描次數(shù)、脈沖寬度等實驗參數(shù)的優(yōu)化，用QNMR內標法測定了黃芩素的純度。實驗中以用于定量的內標峰(苯甲酸峰)和樣品峰盡可能避開干擾為原則，分別把苯甲酸C-2，2'(δ=7.9457，2H)，黃芩素 C-3(δ=6.9287，1H)選為定量峰。

圖6 黃芩素(內標苯甲酸)的QNMR譜圖

表1 黃芩素純度標準物質純度測定結果 %

2.3 雜質的分析

水分的測定結果為0.538%。

無機元素 Li，Be，B，Na，Mg，Al，Si，S，Cl，K，Ca，Sc，Ti，V，Cr，Mn，F(xiàn)e，Co，Ni，Cu ，Zn，Ga，Ge，As，Se，Br，Kr，Rb，Sr，Y，Zr，Nb，Mo，Ru，Rh，Pd，Ag，Cd，In，Sn，Sb，Te，I，Cs，Ba，La，Ce，Pr，Nd，Sm，Eu，Gd，Tb，Dy，Ho，Er，Tm，Yb，Lu，Hf，Ta，W，Re，Os，Ir，Pt，Au，Hg，Tl，Pb，Bi，Th 和 U的含量和為0.0000986%。

2.4 黃芩素純度標準物質均勻性檢驗和穩(wěn)定性考察

按1.6方法進行標準物質均勻性檢驗和穩(wěn)定性考察，結果見表2、表3。

通過F和t檢驗法對黃芩素純度標準物質的均勻性進行檢驗，發(fā)現(xiàn)瓶間和瓶內均勻性一致。在穩(wěn)定性考察中發(fā)現(xiàn)定值結果沒有出現(xiàn)顯著的逐漸增大或減少的趁勢，證明黃芩素純度標準物質是穩(wěn)定的。

2.5 不確定度評定

黃芩素純度標準物質定值結果的不確定度來源有標準物質的定值過程引入的不確定度、標準物質的不均勻性引入的不確定度和標準物質的不穩(wěn)定性引入的不確定度3部分組成。由標準物質均勻性檢驗和穩(wěn)定性考察結果可知，該標準物質均勻性和穩(wěn)定性良好，均符合標準物質的技術要求，故該部分不確定度可忽略不計[15-18]。

表2 黃芩素純度標準物質均勻性檢驗結果 %

表3 黃芩素標準物質穩(wěn)定性檢驗結果 %

2.5.1 高效液相色譜法的測量不確定度

(1)高效液相色譜法定值測量重復性引入的不確定度u1由測量結果的相對標準偏差計算得到，經(jīng)計算u1=0.01%。

(2)各組分在不同檢測波長下響應差異引入的不確定度u2

綜合考慮主成分和雜質化合物在相應檢測波長處的響應，計算得u2=0.04%。

合成得高效液相色譜的測量不確定度：

2.5.2 QNMR法的測量不確定度

(1)QNMR法定值測量重復性引入的不確定度u3(A類不確定度)，由7次測量結果的相對標準偏差計算得u3=0.36%。

(2)黃芩素和苯甲酸的相對分子質量的不確定度

從IUPAC的原子量表中查得C，H，O中各元素的原子量和不確定度，經(jīng)計算得：u(MC15H10O5)＝0.00699 g／moL ；u(MC7H6O2)＝ 0.00326 g／moL。

其不確定度在千位上可以忽略不計。

(3)苯甲酸內標引入的不確定度

由國家一級標準物質苯甲酸的證書可知其不

2.5.4 擴展不確定度

2.6 定值結果

黃芩素標準物質的純度：

其中：Pm為水分含量；Pa為無機元素含量；PHPLC為HPLC-VWD定值主成分峰的百分比值；PQNMR為QNMR定值主成分的含量。

研制的黃芩素純度標準物質定值結果為(98.8±0.8)%，k=2。

3 結論

對黃芩素純度標準物質原料經(jīng)過質譜、紅外光譜定性分析后，分別進行了水分、無機元素含量分析。采用HPLC和QNMR兩種定值方法對黃芩素原料純度進行定值，并對黃芩素純度標準物質進行了均勻性、穩(wěn)定性檢測和定值不確定度評定。研制的黃芩素純度標準物質可應用于相關食品、中藥產(chǎn)品、保健品的質量監(jiān)控，為實現(xiàn)我國準確定量檢測藥品、食品與相關物質提供了標準物質資源和物質純度標準。確定度為0.1%，按均勻分布考慮，苯甲酸內標引入的不確定度u4＝0.06%。

(4)天平稱量引入的不確定度

樣品稱量使用分析天平的最小分度為0.1 μg，天平的變動性、檢定誤差等估計為0.5 μg，估算其標準不確定度為u5＝0.01%。

合成得QNMR法的測量不確定度：

2.5.3 定值結果的合成不確定度

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