斯氏并殖吸蟲抗原致大鼠腦組織病變的光鏡、電鏡觀察＊

黃玉清，李珍煉，陳文碧，佘俊萍，楊朝鮮，程基焱，王光西

2.瀘州醫(yī)學院病原生物學教研室，瀘州 646000；

3.瀘州醫(yī)學院醫(yī)學基礎科研中心，瀘州 646000

斯氏并殖吸蟲散在流行于我國四川、重慶、甘肅、福建等15個省、市、自治區(qū)，是重要的食源性寄生蟲病病原體，由于人不是斯氏并殖吸蟲的正常宿主，童蟲不能在人體內(nèi)發(fā)育至性成熟產(chǎn)卵，很少進入肺臟形成典型囊腫［1］。因生食或半生食含囊蚴的溪蟹而感染，童蟲鉆過腸壁移行至皮下或組織器官，引起游走性皮下結(jié)節(jié)，還侵犯腦和脊髓，引起顱內(nèi)占位、破壞、出血、水腫，可表現(xiàn)為癲癇、偏癱等，嚴重者可終身殘疾［2］。蟲體移行的機械破壞作用、代謝分泌物等抗原的致敏作用是其主要致病機制。

本文通過腦立體定位儀微量注射斯氏并殖吸蟲成蟲抗原至大鼠大腦皮質(zhì)，模擬肺吸蟲腦病大鼠模型，通過光鏡和電鏡觀察病理變化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗動物 健康雄性SPF級SD雄性大鼠，體重（360±20）g，共6只，由瀘州醫(yī)學院實驗動物中心提供。

1.1.2 主要試劑 多聚甲醛，骨蠟購自上海三友外科器械有限公司；二甲苯、中性多聚甲醛、無水乙醇購自四川航嘉生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 腦立體定位儀（NARISHIGESN－3型，日本）；透射電子顯微鏡（JEM－1400，日本）；超薄切片機（萊卡2150）。

1.2 方法

1.2.1 獲取斯氏并殖肺吸蟲成蟲，制備抗原 采取斯氏并殖吸蟲病流行區(qū)溪蟹；研碎、多次換水沉淀至清；解剖顯微鏡下分離獲取囊蚴，鑒定為斯氏并殖吸蟲囊蚴，采用腹腔注射法感染家犬，每只犬注射200個囊蚴，共感染3只犬，飼養(yǎng)觀察3個月。解剖犬，無菌條件下從犬肺及肝蟲囊中取出成蟲。蟲體經(jīng)滅菌生理鹽水洗凈、剪碎、干燥、研磨、脫脂，再經(jīng)冷浸；3 000 r/min離心，取上清，測其蛋白含量6.735 mg/mL，分裝冰箱（－20℃）保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 大鼠并殖吸蟲腦病模型［3］實驗組和對照組各3只大鼠，用1%的戊巴比妥鈉用腹腔注射麻醉，實驗組：腦立體定向儀下15 min內(nèi)緩慢注射并殖吸蟲抗原50μL，在無菌條件下進行；飼養(yǎng)觀察24 h。

1.2.3 大鼠的灌注固定和腦組織取材 大鼠麻醉后，開胸，灌注4℃的4%多聚甲醛磷酸緩沖液400～600 m L，以進針中心取鼠腦，置入10%中性福爾馬林液中固定。

1.2.4 組織病理學觀察 取腦組織，經(jīng)固定、石蠟包埋，4 μm切片后常規(guī)脫水、蘇木素－伊紅染色、脫水透明、封片鏡檢。

1.2.5 電鏡觀察 將腦組織置4%戊二醛液固定1 h；以0.1 mol/L磷酸緩沖液沖洗3次，每次30 min；后用1%四氧化鋨固定1 h，同樣方法沖洗3次；丙酮系列脫水，丙酮：包埋劑Epon 8l2環(huán)氧樹酯（1∶1和1∶2）與純包埋劑系列滲透，包埋聚合；超薄切片；經(jīng)鈾鉛雙重染色；在電子顯微鏡下觀察。

2 結(jié) 果

2.1 光鏡檢查

2.1.1 正常對照組 大鼠腦神經(jīng)元和尼氏小體完整，見圖1。

2.1.2 實驗組 大鼠腦血腫周圍腦組織水腫明顯（組織疏松、細胞間隔增寬），且局灶狀壞死；毛細血管輕度增生、充血；神經(jīng)元皺縮，尼氏小體溶解，周圍出現(xiàn)間隙，神經(jīng)突呈淺淡或消失；可見嗜酸性粒細胞，單核細胞及膠質(zhì)細胞反應，見圖2。

2.2 電鏡觀察

2.2.1 對照組 大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元核仁清晰，核膜完整；染色質(zhì)均勻，線粒體無腫脹，線粒體嵴結(jié)構(gòu)正常；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)正常。

2.2.2 實驗組 大腦皮質(zhì)可見暗細胞。大腦皮質(zhì)中神經(jīng)元胞體腫脹，核移位且形狀不規(guī)則，核膜凸凹不平、模糊、斷續(xù)甚至溶解消失，核質(zhì)溢出；常染色質(zhì)為不均勻的絮狀，異染色質(zhì)多，呈濃密的團塊狀，核仁絨球形；線粒體電子密度增高，腫脹，嵴斷裂；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張呈囊泡化；高爾基復合體扁囊擴張、結(jié)構(gòu)紊亂；溶酶體少見；脂褐素、糖原較多；神經(jīng)膠質(zhì)細胞核核膜清晰，異染色質(zhì)多，見圖3－5。

圖1 對照組鼠腦組織神經(jīng)元和尼氏小體完整，HE×100Fig.1 Intact neurons and nissl in rat brain in normal group，HE×100

圖2 實驗組鼠腦皮質(zhì)H神經(jīng)元固縮，HE×200Fig.2 Cortex neuron pyknosis in rat brain in antigen injection group，HE×200

3 討 論

圖3 實驗組鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元細胞核水腫（A），染色質(zhì)溶解（C），核膜（D），核仁（b）形態(tài)正常，核周間隙（E）清晰，細胞器大面積水腫，線粒體水腫，嵴破壞（F），×10000Fig.3 Cerebral cortical neurons in the nucleus edema（A），the chromatin solution （C），the nuclear membrane（D），nucleolus（B），perinuclear space（E），and cristae damage（F）in the rat brain in antigen injection group，×10 000

圖4 實驗組鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張（A），脂褐素明顯（B），×15000Fig.4 Neurons in the endoplasmic reticulum expansion（A），and significant lipofuscin（B）in rat brain cortex in antigen injection group，×15 000

肺吸蟲的致病主要由童蟲及成蟲的機械性損傷及蟲體代謝產(chǎn)物等抗原物質(zhì)導致的免疫病理反應引起，臨床表現(xiàn)多樣，有胸肺型、皮膚型、腦脊髓型、腹型、肝型、心包型、眼型、陰囊腫塊型、亞臨床型［4］。斯氏并殖吸蟲童蟲移行侵入腦內(nèi)，包括腦膜、脊髓膜、腦實質(zhì)，造成腦型肺吸蟲病。臨床多表現(xiàn)為頭痛、發(fā)熱、嘔吐、頸強直及顱內(nèi)高壓癥狀與局限性神經(jīng)體征，難與腦膜炎、腦腫瘤準確區(qū)分。有關(guān)肺吸蟲引起腦損傷的機制報道不多。由于很難取得并殖吸蟲對腦組織損害標本，本實驗通過腦立體定位儀微量注射并殖吸蟲抗原至大鼠大腦皮質(zhì)，模擬并殖吸蟲損傷腦組織；在光鏡、電鏡觀察其所致的病理變化。實驗鼠腦組織水腫明顯，且局灶狀壞死，神經(jīng)元皺縮，尼氏小體溶解，神經(jīng)突呈淺淡或消失，可見單核細胞及膠質(zhì)細胞反應。表明斯氏并殖吸蟲腦病模型大鼠腦組織有嚴重炎癥病理反應。電鏡觀察到抗原注射大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元胞體腫脹，核移位且形狀不規(guī)則，核膜凸凹不平，線粒體腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，脂褐素較多。表明肺吸蟲抗原注射大鼠腦可引起腦組織超微結(jié)構(gòu)改變：細胞腫脹，線粒體腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張。肺吸蟲的機械破壞和細胞毒素抗原等炎癥分子，引起大鼠腦組織和細胞超微結(jié)構(gòu)病理改變。

圖5 實驗組鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元線粒體（B）水腫嵴斷裂、空泡化，細胞核不規(guī)則，核膜溶解，凹凸不平（A）×10 000Fig.5 Mitochondria edema crest fracture（B），vacuolization，nuclear irregularity，nuclear membrane dissolves，uneven surfaces（A）in rat brain cortex in antigen injection group，×10 000

［1］Liu Q，Wei F，Liu W，et al.Paragonimiasis：an important foodborne zoonosis in China［J］.Trends Parasitol，2008，24（7）：318－323.DOI：10.1016/j.pt.2008.03.014

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