亞洲帶絳蟲(chóng)六鉤蚴Ta 8基因的克隆表達(dá)及免疫原性分析＊

王 宇，程金芝，黃 江，戴佳琳，陳小睿，廖興江

2.貴州省疾病預(yù)防控制中心，貴陽(yáng) 550004

至20世紀(jì)70年代以來(lái)，在我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)、東南亞地區(qū)和我國(guó)大陸地區(qū)相繼報(bào)道了一種帶絳蟲(chóng)，其成蟲(chóng)特征幾乎和牛帶絳蟲(chóng)一致，而囊尾蚴又與豬帶絳蟲(chóng)極為相似。這種帶絳蟲(chóng)的中間宿主是豬，人因生食豬肝等內(nèi)臟而感染。這種帶絳蟲(chóng)被命名為亞洲帶絳蟲(chóng)［1］。近年來(lái)的研究證實(shí)在貴州省都勻地區(qū)存在亞洲帶絳蟲(chóng)病的流行［2］。但是由于傳統(tǒng)的病原學(xué)方法診斷該病較困難，尤其易與牛帶絳蟲(chóng)混淆，使免疫學(xué)方法以其費(fèi)用低廉、操作簡(jiǎn)單、特異性高等特點(diǎn)成為目前診斷中的重要輔助診斷手段，其中篩選特異性好、敏感性高的診斷抗原成為免疫學(xué)診斷技術(shù)研究的關(guān)鍵。本研究通過(guò)構(gòu)建p ET－28a（＋）－Ta8原核表達(dá)載體，并對(duì)其原核表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化和免疫學(xué)初步研究。篩選具有免疫原性和潛在診斷價(jià)值的候選抗原基因，為絳、囊蟲(chóng)病免疫診斷方法的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來(lái)源，質(zhì)粒，菌株 蟲(chóng)體標(biāo)本采自亞洲帶絳蟲(chóng)流行區(qū)貴州省都勻市米秀鄉(xiāng)；原核表達(dá)質(zhì)粒p ET－28a（＋）和大腸桿菌BL21/DE3由中山大學(xué)熱帶病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑和工具酶 TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTMRT reagent Kit）購(gòu)自日本Ta KaRa公司，Ex Taq酶、EcoR I、HindⅢ、DNA標(biāo)準(zhǔn)（DL15 000、DL2 000）均購(gòu)自大連寶生物工程公司，T4 DNA連接酶、異丙基－β－D－硫代半乳糖苷（IPTG）均購(gòu)自美國(guó) Promega公司，Ni－IDA Agarose（Cat.No.30210）購(gòu)自德國(guó)NOVEGN公司，兔抗鼠Ig G試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自廣州東盛科技公司，低分子量蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自立陶宛Fermentas公司，DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自廣州鉑爾生物科技公司。

1.1.3 引物的合成和DNA的測(cè)序 基因擴(kuò)增引物由Invitrogen上海生物技術(shù)有限公司合成，重組質(zhì)粒DNA的測(cè)序由金斯特科技股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 亞洲帶絳蟲(chóng)蟲(chóng)卵孵化、六鉤蚴總RNA的提取及c DNA的合成 取新鮮亞洲帶絳蟲(chóng)成蟲(chóng)孕節(jié)，用滅菌生理鹽水清洗干凈，用剪刀剪碎，4 000 r/min離心5 min。用滅菌生理鹽水洗3次（4 000 r/min離心5 min），用顯微鏡計(jì)數(shù)。將分離的蟲(chóng)卵放入培養(yǎng)皿中，加入次氯酸鈉溶液，使蟲(chóng)卵胚膜破裂，待胚膜破裂完后立即用生理鹽水洗3次，沉淀用少量生理鹽水重懸沉淀，加入人工胰液，37℃水浴40 min激活六鉤蚴，用生理鹽水洗3次后，將沉淀立刻放進(jìn)DEPC水處理的勻漿器中，加入1 m L TRIzol后勻漿，直至樣品全部融化成液體，將其移入無(wú)菌且RNase free EP管，用力振蕩3 min，室溫靜置5 min。加入0.2 m L氯仿，混合后靜置10 min，4℃12 000 g離心20 min，小心取上清液到一個(gè)新的RNase free EP管中。加入0.5 m L異丙醇，室溫靜置10 min，4℃12 000 g離心15 min，棄上清液。沉淀加入1 m L 75%乙醇，震蕩15 s，4℃7 500 g離心5 min，棄上清液，倒置在超凈臺(tái)上10 min，加入30 μL純水溶解沉淀，所獲得的總RNA保存于－80℃冰箱中。取適量的RNA樣品合成cDNA，反應(yīng)體系為：模板2μL（500ng），5×PrimeScript緩沖液2 μL，PrimeScript酶混合物0.5μL，Oligod T和Random 6 mers引物各0.5μL，加RNase Free d H2O至總體系為10μL。反應(yīng)條件：37℃30 min，85℃5 s。－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)合成、基因擴(kuò)增 根據(jù)Gen－Bank上豬帶絳蟲(chóng)相關(guān)8 k Da基因序列，用Premier 5.0 設(shè) 計(jì) 引 物，P1：5′－CGCGAATTCGTATCGGCTTGTAAAATT－3′，帶EcoR I酶切位點(diǎn)；P2：5′－CGCAAGCTTTTAAGCAGTTTTGTTCTTCAGAC－3′，帶HindⅢ酶切位點(diǎn)。以亞洲帶絳蟲(chóng)六鉤蚴cDNA為模板，應(yīng)用上述設(shè)計(jì)的特異引物擴(kuò)增目的基因，PCR產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定回收、測(cè)序鑒定。

1.2.3 檢測(cè)Ta8基因在亞洲帶絳蟲(chóng)中不同時(shí)段、以及成蟲(chóng)不同部位的表達(dá)情況 成蟲(chóng)頭節(jié)、成節(jié)、孕節(jié)總RNA的提取及cDNA的合成除不用孵化蟲(chóng)卵外其余步驟與提取六鉤蚴總RNA相同。采用RTPCR方法用合成的特異引物分別擴(kuò)增六鉤蚴、成蟲(chóng)頭節(jié)、成節(jié)、孕節(jié)總RNA中的Ta8基因，行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。

1.2.4 重組原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 將六鉤蚴PCR產(chǎn)物膠回收后和原核表達(dá)質(zhì)粒p ET－28a（＋）用EcoRI和HindⅢ進(jìn)行雙酶切后回收，連接、轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21/DE3感受態(tài)細(xì)胞，卡拉霉素篩選陽(yáng)性單克隆，提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切、PCR和DNA測(cè)序鑒定后進(jìn)行原核表達(dá)。

1.2.5 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 挑取含有p ET－28a（＋）Ta8重組質(zhì)粒的E.coliBL21/DE3的單菌落接種于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中（空質(zhì)粒p ET－28a（＋）的BL21/DE3作為陰性對(duì)照），放入37°C搖床，搖至OD600約為0.6時(shí)，取1 m L作為誘導(dǎo)前樣品，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，搖床誘導(dǎo)表達(dá)5 h后離心收集菌體作為誘導(dǎo)后樣品，所有樣品離心后收集菌體處理后離心取上清行SDS－PAGE電泳分析。

1.2.6 重組蛋白的純化、抗體制備和蛋白質(zhì)印跡（Western blot）分析 依據(jù)上述誘導(dǎo)表達(dá)方法對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行大量的誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集菌體，冰上超聲裂解，分別取上清和沉淀樣品處理后行SDSPAGE判斷重組蛋白的可溶性。尿素變性純化重組蛋白，按參考文獻(xiàn)［3］方法進(jìn)行，用Bradford法測(cè)蛋白濃度，并于－80℃保存?zhèn)溆谩Ｓ眉兓牡鞍着c弗氏佐劑混勻免疫SD大鼠，每2 w免疫1次，第3次免疫后1 w取大鼠血清分離抗體，小份分裝于－20℃保存?zhèn)溆?，用前滅活。純化的Ta8蛋白經(jīng)SDS－PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC膜），用5%脫脂奶粉封閉過(guò)夜，第2 d取出后用PBS洗滌3次，用NC膜與健康大鼠血清和Ta8蛋白抗原免疫大鼠血清（作為一抗，1∶100）室溫孵育2 h，用PBS洗滌3次，5 min/次。再將膜與兔抗鼠HRPIgG（作為二抗，1∶2 000）室溫孵育1.5 h，PBS洗滌3次，加入二氨基聯(lián)苯胺（DAB）試劑顯色，觀察結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 RNA提取和8 k Da序列分析 對(duì)亞洲帶絳蟲(chóng)六鉤蚴提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260/280為2.02，取部分 RNA合成cDNA，RTPCR擴(kuò)增目的基因后膠回收，通過(guò)測(cè)序后用生物信息學(xué)對(duì)序列進(jìn)行識(shí)別分析。從BLASTx的分析結(jié)果來(lái)看，該基因與豬帶絳蟲(chóng)8 k Da基因（登錄號(hào)為AAM00212.1）的氨基酸序列的同源性達(dá)80%，所以推測(cè)為亞洲帶絳蟲(chóng)六鉤蚴8 k Da基因，含有一個(gè)最長(zhǎng)的ORF就是其完整的編碼區(qū)，起始密碼為ATG，終止密碼為T(mén)AA，編碼83個(gè)氨基酸，見(jiàn)圖1。其理論分子量和等電點(diǎn)分別為9 416.1 Da和9.47。

圖1 Ta 8基因序列及其ORF編碼的氨基酸序列Fig.1 Sequence of Ta 8 gene and the amino acid sequence encoded by the ORF

2.2 檢測(cè)Ta8基因在亞洲帶絳蟲(chóng)中不同時(shí)段、以及成蟲(chóng)不同部位的表達(dá)情況 采用RT－PCR方法，通過(guò)特異性擴(kuò)增六鉤蚴、成蟲(chóng)頭節(jié)、成節(jié)、孕節(jié)cDNA中的Ta8基因，結(jié)果顯示Ta8基因不僅在六鉤蚴中表達(dá)，在成蟲(chóng)的不同部位也同時(shí)表達(dá)，見(jiàn)圖2。

圖2 Ta 8基因在六鉤蚴、成蟲(chóng)頭節(jié)、成節(jié)、孕節(jié)階段的表達(dá)1：六鉤蚴；2：頭節(jié)；3：成節(jié)；4：孕節(jié)；M：DNA 標(biāo)志物；5：陰性對(duì)照Fig.2 The expression of Ta 8 gene in oncosphere，scolex，and mature and gravid proglottids1：Oncosphere；2：Scolex；3：Mature proglottids；4：Gravid proglottids；M：DNA marker；5：Negative control

2.3 原核重組質(zhì)粒的鑒定、分析 將重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果顯示約240 bp處有一清晰的條帶，與目的基因的大小基本相符，見(jiàn)圖3，測(cè)序證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖3 重組質(zhì)粒的PCR及雙酶切鑒定M1：DNA標(biāo)志物2 000；1：從亞洲帶絳蟲(chóng)六鉤蚴cDNA中擴(kuò)增的 PCR 產(chǎn)物；2：重組質(zhì)粒（p ET－28a（＋）－Ta8）用Eco RⅠ和 Hin dⅢ酶切；3：重組質(zhì)粒（p ET－28a（＋）－Ta 8）；M2：DNA標(biāo)志物15 000。Fig.3 Identification of the pET－28a（＋）－Ta8 by PCR amplification and digestion with restriction enzymesM1：DNA marker DL2000；1：PCR product amplified from cDNA of Taenia asiatica oncosphere；2：Recombinants（p ET－28a（＋）－Ta8）digested by Eco RⅠ and Hin dⅢ；3：Recombinants（p ET－28a（＋）－Ta8）；M2：DNA marker DL15000

2.4 蛋白表達(dá)純化結(jié)果 將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliBL21/DE3中表達(dá)，SDS－PAGE電泳分析結(jié)果第4、6泳道所示，大約在11 k Da左右處出現(xiàn)表達(dá)條帶，與目的蛋白分子量基本相符。將蛋白進(jìn)行純化，結(jié)果第7泳道所示，證明目的蛋白純化成功。用Bradford法測(cè)該蛋白濃度為0.65 mg/m L，見(jiàn)圖4。

圖4 重組質(zhì)粒的表達(dá)及其純化產(chǎn)物的15%SDS－PAGE電泳分析M：蛋白標(biāo)志物；1：p ET－28a（＋）質(zhì)粒未加IPTG 誘導(dǎo)；2：p ET－28a（＋）質(zhì) 粒 加 IPTG 誘 導(dǎo)；3：p ET－28a（＋）－Ta 8質(zhì)粒未加IPTG 誘導(dǎo)；4：p ET－28a（＋）－Ta 8質(zhì)粒 加IPTG 誘 導(dǎo)；5：p ET－28a（＋）－Ta 8質(zhì) 粒 加IPTG誘 導(dǎo) 后 上 清；6：p ET－28a（＋ ）－Ta 8 質(zhì) 粒 加IPTG誘 導(dǎo) 后 沉 淀；7：p ET－28a（＋ ）－Ta 8 質(zhì) 粒 加IPTG誘導(dǎo)后純化產(chǎn)物。Fig.4 15%SDS－PAGE analysis of the prokaryotic expression product and purified productM：Protein marker；1：p ET－28a（＋）transformants without IPTG induction；2：p ET－28a（＋）transformants with IPTG induction；3：p ET－28a（＋）－Ta 8 transformants without IPTG induction；4：p ET－28a（＋ ）－Ta 8 transformants with IPTG induction；5：Insoluble protein of p ET－28a（＋）－Ta 8 transformants；6：Sediments of lysate p ET－28a（＋）－Ta 8 with IPTG induction；7：Purification of insoluble protein of p ET－28a（＋）－Ta 8 transformants

2.5 Western blot鑒定重組蛋白Ta8的免疫原性

純化得到的重組蛋白Ta8行15%SDS－PAGE，Western Blot分析，使用SD大鼠抗重組蛋白Ta8的特異抗血清作為一抗，結(jié)果顯示特異性抗血清能識(shí)別重組蛋白Ta8，而正常大鼠血清不能識(shí)別，見(jiàn)圖5。

3 討 論

亞洲帶絳蟲(chóng)與牛帶絳蟲(chóng)的形態(tài)結(jié)構(gòu)很相似，使用傳統(tǒng)的病原學(xué)方法診斷該病較困難，目前對(duì)亞洲帶絳蟲(chóng)的診斷最可靠的方法是靠驅(qū)蟲(chóng)后對(duì)該蟲(chóng)線(xiàn)粒體Cox1基因片段的鑒定和形態(tài)結(jié)構(gòu)特征共同確定蟲(chóng)種［4］，但是該技術(shù)操作繁瑣，使免疫學(xué)方法以其費(fèi)用低廉、操作簡(jiǎn)單、特異性高等特點(diǎn)成為目前診斷中的重要輔助診斷手段，其中篩選特異性好、敏感性高的診斷抗原成為免疫學(xué)診斷技術(shù)研究的關(guān)鍵。

圖5 重組Ta 8蛋白的免疫原性M：蛋白標(biāo)志物；1：重組蛋白免疫SD大鼠后血清；2：健康大鼠血清。Fig.5 Immunogenicity of recombinant Ta 8M：Protein marker；1：Recombinant p ET－28a（＋）－Ta 8 reacted with serum from immunized SD rat；2：Crude antigens reacted with serum from normal rat

目前，用于帶絳蟲(chóng)科診斷研究的抗原不多，8 k Da蛋白為其中之一。有研究報(bào)道帶絳蟲(chóng)科8 k Da蛋白具有很高的免疫原性和診斷價(jià)值，可作為帶絳蟲(chóng)病或者囊蟲(chóng)病的診斷抗原［5－6］。帶絳蟲(chóng)科8 k Da蛋白是一個(gè)很大的家族，每個(gè)基因之間序列差別較大，Hancock等［7］表達(dá)了豬帶絳蟲(chóng)18種8 k Da蛋白，其中9種8 k Da蛋白經(jīng)ELISA檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)對(duì)人陽(yáng)性豬囊蟲(chóng)病血清表現(xiàn)出的敏感性和特異性都為100%，因此可以推測(cè)亞洲帶絳蟲(chóng)8 k Da蛋白也可能是亞洲帶絳蟲(chóng)病的重要免疫診斷抗原之一。

成功從亞洲帶絳蟲(chóng)六鉤蚴的cDNA中獲得8 k Da基因，并構(gòu)建了p ET－28a（＋）－Ta8重組質(zhì)粒，測(cè)序后序列經(jīng)NCBI網(wǎng)站Blastx在線(xiàn)分析，該基因與豬帶絳蟲(chóng)8 k Da基因（登錄號(hào)為AAM00212.1）的氨基酸序列的同源性達(dá)80%，含有一個(gè)最長(zhǎng)的ORF就是其完整的編碼區(qū)，編碼83個(gè)氨基酸，其理論分子量和等電點(diǎn)分別為9 416.1Da和9.47。蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)較穩(wěn)定。Western Blot結(jié)果表明重組蛋白能被其免疫的SD大鼠血清識(shí)別而不能夠被正常SD大鼠血清識(shí)別，說(shuō)明重組蛋白具有免疫原性。采用RT－PCR方法檢測(cè)8 k Da基因在亞洲帶絳蟲(chóng)六鉤蚴、以及成蟲(chóng)不同部位的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)8 k Da基因不僅在六鉤蚴階段表達(dá)，在成蟲(chóng)頭節(jié)、成節(jié)、孕節(jié)中均表達(dá)，這樣就大大提高了采用血清來(lái)診斷亞洲帶絳蟲(chóng)病的可能性，為進(jìn)一步開(kāi)展診斷試劑盒或試紙條的研究提供了有利條件。

綜上所述，8 k Da基因是一個(gè)龐大的家族，要全面的了解其成員的功能，必須進(jìn)一步研究其同源的基因，才能更好地篩選潛在的候選抗原。

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