蘇打堿脅迫對多年生黑麥草的生理影響

郭慧娟，胡濤，傅金民

（中國科學院武漢植物園植物種質創(chuàng)新與特色農業(yè)重點實驗室，湖北 武漢430074）

土地鹽堿化已成為世界性的環(huán)境問題。一般在氣候干燥的半干旱、干旱地區(qū)由于降水量少而蒸發(fā)強烈，鹽分不斷積累于地表；而在農業(yè)生產中，長期不合理的施用化肥及用污水灌溉都會造成土壤鹽漬化。由于環(huán)境變化和土地的不良使用，使得土地鹽堿化趨勢加?。?］。據(jù)報道，全世界約有4億公頃的鹽漬土，約占灌溉農用地的1／3，在中國6.7×107hm2耕地中就有10%的鹽漬化土壤。鹽堿脅迫是影響植物生長發(fā)育，導致產量和品質下降的主要非生物逆境因素［2］。土壤中的致害鹽類除了以NaCl為主的中性鹽以外，還有以Na2CO3和NaHCO3為主的堿性鹽，目前我國內陸鹽堿地蘇打鹽堿土占的比重也越來越大［3］，由于上述堿性鹽的存在，這類土壤的pH可以高達9以上。正常情況下，植物在生命活動中產生的活性氧自由基存在著產生和消除的動態(tài)平衡。環(huán)境脅迫引起的滲透脅迫和離子毒害使植物細胞的葉綠體和線粒體在電子傳遞中的電子數(shù)量增加，活性氧產生與清除的動態(tài)平衡遭到破壞［4，5］，超氧陰離子和H2O2等活性氧的積累誘發(fā)膜脂過氧化，使膜透性增加，從而導致膜系統(tǒng)的氧化和細胞傷害，給植物體造成嚴重的損傷［6］，使植株的光和作用下降，產量降低［7］?；钚匝跚宄到y(tǒng)由酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)組成。超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase，SOD）與過氧化氫酶（catalase，CAT）、過氧化物酶（peroxydase，POD）以及B2胡蘿卜素等物質協(xié)同作用，可防御活性氧或其他過氧化物自由基對細胞膜系統(tǒng)的傷害。堿脅迫條件下，它們作為氧自由基的清除者，可以減輕逆境對植物細胞的傷害［8］。

迄今為止有關植物抗鹽生理的研究仍然以NaC1為主要對象的鹽脅迫為主，而自然生境對植物的危害不單有鹽脅迫，同時也有堿脅迫，尤其是以Na2CO3和NaHCO3為主的蘇打堿對植物的危害較大。鹽堿脅迫是植物生長最主要也是最常見的非生物脅迫之一，對于大多數(shù)生長在鹽堿土生境中的植物來說，它們不僅要遭受Na＋毒害，還要忍受高水平pH對生長的影響。本研究選擇多年生黑麥草（Lolium perenne）作為研究對象，它是一種重要的禾本科牧草和草坪草，喜溫濕、耐瘠薄、耐鹽堿，在新平整的生土或新開墾的鹽荒地上均可生長，廣泛分布于溫帶地區(qū)。作為牧草，黑麥草的草質優(yōu)良，產量高，葉量豐富，莖葉柔嫩，適口性好，是馬、牛、羊、兔草食家畜的優(yōu)質牧草；也是養(yǎng)魚的好飼料。做為草坪草，黑麥草具有建坪速度快、覆蓋能力和抗病蟲害能力以及分蘗能力強等特性。因此多年生黑麥草是一種理想的研究材料［9］。對于多年生黑麥草的堿脅迫效應，國內外極少報道。本試驗從多年生黑麥草的生長狀況及其光合色素含量和抗氧化作用方面探討蘇打堿對其的脅迫效應，以探討多年生黑麥草堿脅迫的適應機制，并揭示其耐堿的可能機理，為進一步利用鹽堿地（主要是堿土）種植黑麥草提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗于2010年7月7日－8月24日在中國科學院武漢植物園進行，多年生黑麥草quickstarⅡ的種子由中國科學院武漢植物園草坪種質資源學科實驗室提供。黑麥草種子在裝有沙子的一次性水杯中萌發(fā)，每天用半劑量Hoagland營養(yǎng)液少量多次的澆灌，并保證上半層沙子處于濕潤的狀態(tài)，約50d后將幼苗轉移到300mL三角瓶中，用半劑量的Hoagland營養(yǎng)液完全水培，培養(yǎng)7d后可進行堿脅迫實驗。為防止藻類植物在水培液中生長，三角瓶外面用錫箔紙包裹。

1.2 方法

本實驗設置5個不同pH梯度的蘇打堿處理液，即去離子水pH＝6.5（對照）、pH＝8.2、pH＝9.1、pH＝9.9、pH＝10.9。分別配置0.1mol／L的 Na2CO3和0.1mol／L的 NaHCO3溶液，并將上述溶液按照0∶0，0∶10，1∶9，5∶5，9∶1的比例配成相應pH值處理液，每個處理4次重復，溫度控制在19～21℃，光照時間為14 h／10h（晝／夜）。處理4d后，分別測定和計算各處理的相對蒸騰速率、含水量、株高、根長、根冠比、葉綠素含量等生長狀況指標以及抗氧化酶的活性。

1.2.1 相對蒸騰速率的測定 蒸騰速率是一個與植物的生長密切相關，并且比較容易和快速得到的指標。每隔24h將密封好的三角瓶稱重并記錄數(shù)據(jù)，將前一天的數(shù)據(jù)減去當天的數(shù)據(jù)得出來的差值就是這24h之內的絕對蒸騰速率。為了糾正正常生長的幼苗長得越快，蒸騰量越大的錯誤觀點，通過計算可以得出相對蒸騰速率（normalized relative transpiration，NRT）。

式中，T代表多年生黑麥草幼苗的絕對蒸騰速率（g／h），t代表時間段（0～24h，24～48h，…），C代表溶液濃度（g／L），i代表實驗的重復1，2，...，n，j代表對照組實驗重復1，2，...，m。

1.2.2 含水量、株高、根長和根冠比的測定 處理結束后，將多年生黑麥草幼苗沖洗干凈，并把多余的水吸干，分別用直尺測量一下植株的株高和根長，并記錄數(shù)據(jù)，根冠比用植株的根長比株高得出的商值。然后稱量植株的總鮮重，再將葉和根分開，并分別稱量鮮重。然后用牛皮紙袋將鮮樣包好，于烘箱中110℃殺青30min，后在70℃烘干至恒重并進行干物質重測定。含水量的計算公式為

式中，F(xiàn)W為葉和根的鮮重，DW為干物質重。

1.2.3 葉綠素的提取 取處理后的完全展開功能葉片0.1g，放入含10mL二甲亞砜（DMSO）的離心管中，暗中放置2～3d（至葉子失綠），每天混勻1次。吸取1mL萃取液于離心管中，加入DMSO 2mL，混勻。以DMSO為空白對照，使用分光光度計測定OD663、OD645值。并按下式計算葉綠素a和葉綠素b的含量。

1.2.4 粗酶液的提取 稱取0.3g完全展開功能葉片，將葉片置于預冷的研缽中，加入液氮迅速研磨成粉末狀，加入4mL 4℃預冷的150mmol／L、pH 7.0的磷酸緩沖溶液（PBS），將勻漿轉入10mL離心管中，12 000r／min、4℃離心20min，上清液即為粗酶提取液。

1.2.5 可溶性蛋白含量的測定 參照 Bradford［10］的方法。取0.03mL粗酶液加0.07mL 150mmol／L、pH 7.0的磷酸緩沖溶液，加入Brandford染液（0.01%考馬斯亮藍、4.7%乙醇、8.5%磷酸，用錫箔紙包好避光）后充分振蕩，用分光光度計測量OD595，通過由牛血清蛋白溶液繪出的標準曲線，計算出可溶性蛋白含量。

1.2.6 丙二醛（MDA）含量的測定 參照Zhang和 Kirkham［11］的方法。稱取100g TCA（三氯乙酸）、2.5g TBA（硫代巴比妥酸），加雙蒸水定容至500mL作為反應液。取1mL粗酶液加入到2mL反應液中，混合液在95℃水浴30min后迅速冷卻至室溫，振蕩離心管以消除氣泡，在12 000r／min、20℃離心10min，取上清液，以反應液為空白測定OD532、OD600。

式中，L為提取液體積（mL）；l為比色杯厚度（cm）；ε為摩爾吸光系數(shù)（155L／mmol·cm）；FW為樣品鮮重。

1.2.7 超氧化物歧化酶（SOD）活性測定 參照 Giannopolitis和 Ries［8］的方法。用雙蒸水配制1.125mmol／L氮藍四唑（NBT）、195mmol／L甲硫氨酸（Met）、0.06mmol／L核黃素、3μmol／L EDTA－Na2溶液。將0.1mL粗酶液與2.2mL pH 7.8的磷酸緩沖液、0.2mL Met溶液、0.2mL NBT 溶液、0.1mL EDTA－Na2溶液、0.2 mL核黃素溶液，以不加粗酶液和NBT溶液的混合液為空白對照，以不加粗酶液的混合液為處理對照，搖勻后將裝有混合液的透明玻璃燒杯置于4 000lx熒光燈下顯色反應60min，要求各燒杯照光一致，另將一支對照管置于暗中，反應溫度控制在25～35℃。反應結束后用黑布遮蓋試管終止反應，以暗中對照管作空白調0，測定波長560nm下的吸光度。以抑制光下對照管NBT光還原反應50%的酶量作為1個SOD活性單位。

式中，ACK為空白對照在560nm下的吸光度；Atreatment為處理樣品在560nm的吸光度；FW為樣品鮮重。

1.2.8 過氧化物酶（POD）活性的測定 參照Chance和 Maehly［12］的方法。用50%的乙醇配置0.25%的愈創(chuàng)木酚，用雙蒸水配置0.75%的 H2O2溶液、0.1mol／L pH 5.0的醋酸緩沖溶液。取0.05mL粗酶液與1mL愈創(chuàng)木酚溶液、1.85mL醋酸緩沖溶液、0.1mL H2O2混合于離心管中，充分搖勻；以不加酶液管調0，測定波長460nm下的吸光度，于3min內每隔1min讀數(shù)1次。以1min內A460增加1為1個酶活性單位（U）。

式中，ΔA460為反應時間內樣品在460nm下吸光度的變化；FW為樣品鮮重。

1.2.9 過氧化氫酶（CAT）活性的測定 參照 Wang和 Huang［13］的方法。取0.1mL粗酶液加1.9mL 50 mmol／L、pH 7.4的磷酸緩沖溶液，1mL 45mmol／L H2O2溶液，充分振蕩，測量波長240nm下的吸光度，3min內每鎘1min讀數(shù)1次。以1min內A240降低0.01為1個酶活性單位（U）。

式中，ΔA240為反應時間內樣品在240nm下吸光度的變化；FW為樣品鮮重。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析（ANOVA），以及平均數(shù)LSD多重比較檢驗，差異顯著水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 鹽堿脅迫對多年生黑麥草生長狀況和植株含水量的影響

從外觀上看，多年生黑麥草的生長受到了嚴重的抑制。首先，和對照相比，植株的地上部有不同程度的萎蔫失水，葉片皺縮，失綠發(fā)黃等，而且根部也出現(xiàn)了縮短、發(fā)黑和潰爛的現(xiàn)象，這一系列反應就是人們俗稱的“燒苗”。遭受鹽堿脅迫的幼苗株高比對照的矮，差異顯著，但是隨著pH的升高，株高的下降并不明顯（表1）；與對照相比，根長都顯著降低，處理pH＝8.2、pH＝9.1和pH＝9.9之間差異顯著，而當pH＝10.9時，根長和pH＝9.9處理的根長相等；當pH＝8.2和pH＝9.1時，植株的根冠比與對照相比出現(xiàn)了顯著的增大，而其他處理的根冠比與對照無顯著差異。

含水量是直接反映鹽脅迫對植物造成滲透脅迫大小的指標。植物體內必須維持一定的含水量才能進行各種代謝反應和保持正常生長狀態(tài)，進行光合作用，維持正常生長發(fā)育。不同pH值的鹽堿脅迫下，黑麥草幼苗葉片的含水量均顯著下降（表1）。但當pH達到9.9，葉片含水量為42.6%，隨著pH的增大，葉片含水量下降不顯著。對于植株的地下部——根而言，隨著pH的增加，含水量的下降幅度較小，pH＝8.2時，根的含水量下降的幅度并不顯著。而當pH＞9.1時，根系含水量顯著下降，但是各處理之間的差異并不顯著。

表1 pH值對多年生黑麥草株高、根長、根冠比以及植株含水量的影響Table 1 Effects of pH on the shoot height，root length，the ratio of root to shoot and the water content of ryegrass seedlings

2.2 鹽堿脅迫對多年生黑麥草幼苗相對蒸騰速率的影響

蒸騰作用是植株吸收水分的主要動力之一。蒸騰速率直接反應了植株生物量的積累情況。各處理組初始的蒸騰速率都是100%，隨著鹽堿脅迫處理天數(shù)的增加，植株的蒸騰速率出現(xiàn)了急劇地下降，且隨著pH的增加，相對蒸騰速率的下降幅度愈大，且各處理組之間有顯著地差異（圖1）。

2.3 鹽堿脅迫對葉片葉綠素含量的影響

葉綠素作為重要的光合色素分子，參與光能的吸收、傳遞和轉化，在光合作用中占有重要地位。植物受到逆境脅迫時，各種生理過程都會受到影響，從而直接或間接地影響到其含量［14］。由于各處理的黑麥草幼苗的葉片出現(xiàn)了很大程度的失水現(xiàn)象，所以數(shù)據(jù)處理時葉綠素的含量按各處理葉片含水量的大小換算成干重后得來。

與對照相比，各處理的葉綠素a（Chl a）含量顯著降低。當pH＝9.1，pH＝9.9和pH＝10.9時，葉片葉綠素b（Chl b）的含量也有顯著降低。各處理的葉綠素總量（Chl a＋b）顯著低于對照的2.0mg／g DW，而后3組處理之間的差異并不顯著（表2）。

2.4 鹽堿脅迫對抗氧化酶活性和可溶性蛋白含量及丙二醛含量的影響

圖1 pH值對多年生黑麥草幼苗相對蒸騰速率的影響Fig.1 Effects of pH on the relative transpiration rate of ryegrass seedlings

表2 不同pH值下蘇打鹽堿脅迫對多年生黑麥草幼苗葉綠素含量的影響Table 2 Effects of pH on the content of chlorophyll of ryegrass seedlings

2 4.1 對葉片SOD活性的影響 SOD是植物抗氧化系統(tǒng)的第一道防線，能清除細胞中多余的超氧根陰離子，其活性的高低變化反映了植物對氧化損傷的修復能力［15］。隨著堿脅迫pH的遞增，SOD的活性呈先上升后下降的現(xiàn)象，當pH＜9.1時，SOD的活性逐步升高，當pH＝9.1時SOD的活性最高，但與對照差異不顯著。當pH＞9.1時，SOD的活性又開始下降，當pH＝9.9時，基本與對照相等，pH＝10.9時，SOD的活性只有5.4U／mg蛋白，與對照相比顯著降低（表3）。

2.4.2 對葉片CAT活性的影響 CAT主要分布于過氧化物酶體中，能有效地降低植物體內的過氧化氫對細胞的氧化作用［16］。因此，植物體內存在CAT是其保護自身免受活性氧自由基毒害的關鍵因素之一。當pH＝8.2時，CAT的活性與對照相比雖然有所降低，但是差異并不顯著。隨著pH的逐步升高，CAT的活性呈現(xiàn)逐步遞減的趨勢。在pH 8.2～9.1，CAT活性出現(xiàn)了急劇下降，但是差異并不顯著；pH＝9.9的處理與對照相比，CAT的活性有顯著降低，但與pH＝9.1和pH＝10.9兩組處理相比，差異都不顯著（表3）。

2.4.3 對葉片POD活性的影響 POD可清除植物體內SOD催化反應的產物H2O2，從而使需氧生物體免受H2O2的毒害［14］。當pH＝8.2時，POD活性與對照相比雖然有所升高，但是差異并不顯著，其他3組處理與對照組相比都顯著升高。隨著pH的升高，POD的活性逐漸升高，但是pH＝8.2和pH＝9.1兩組之間的差異不顯著，pH＝9.1和pH＝9.9之間的差異也不顯著。最終POD活性增加慢慢趨于平緩以至于不再增加，pH＝9.9和pH＝10.9兩組的POD活性相等（表3）。

表3 pH值對多年生黑麥草葉片中抗氧化酶活性、可溶性蛋白含量和丙二醛含量的影響Fig.3 Effects of pH on the activities of SOD，POD，CAT，the contents of soluble protein and malonaldehyde in the leaves of ryegrass seedlings

2.4.4 對葉片中可溶性蛋白含量的影響 植物體內的可溶性蛋白質大多數(shù)是參與各種代謝的酶類，其含量是了解植物體總代謝水平的一個重要指標［17］。植物體可以通過增加可溶性蛋白的含量，提高滲透調節(jié)能力，增強對鹽堿脅迫的適應能力［18］；高含量的可溶性蛋白可幫助維持植物細胞較低的滲透勢，抵抗水分脅迫導致的傷害，抗旱性強的植物種或品種的可溶性蛋白含量較高［19］。隨著pH的升高，黑麥草葉片中的可溶性蛋白含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當pH≤9.9時，可溶性蛋白的含量逐漸升高至穩(wěn)定，但是隨著堿脅迫程度的進一步加深，可溶性蛋白的含量又顯著下降（表3）。

2.4.5 對葉片中MDA含量的影響 正常生長條件下，植物體內活性氧的產生和清除之間保持著一種動態(tài)平衡，當植物遭受脅迫時，這種平衡就被破壞，首先影響的是生物膜［20］。往往發(fā)生膜脂過氧化作用，丙二醛（malonaldehyde，MDA）是膜脂過氧化作用的主要產物之一，其含量與細胞膜系統(tǒng)的傷害程度密切相關［21］。MDA的含量愈高，脂質過氧化作用愈強。隨著pH的升高，鹽堿脅迫都可以造成黑麥草細胞中MDA含量的逐步增加。在pH 8.2～9.1時，MDA含量的增長幅度較大，而后，增加又相對平緩（表3）。

3 討論

3.1 鹽堿脅迫對多年生黑麥草生長發(fā)育的影響

在蘇打堿脅迫下，多年生黑麥草的發(fā)育明顯遲緩。生長抑制是植物響應鹽漬生境最敏感的生理過程，當植物被轉移到鹽堿逆境中幾分鐘后，生長速度即有所下降。首先，在堿脅迫下，多年生黑麥草幼苗的相對蒸騰速率的降低，表明植株在生長期全部的生命活動受到了抑制，根系吸水與冠部蒸騰之間的平衡被打破，進而植株體內的各種代謝循環(huán)以及物質和能量的傳遞和轉換受到了嚴重影響，生物量的積累自然而然地下降。直接從外觀上看，植株萎蔫失水嚴重，植物葉片含水量的變化一定程度上反應了植株的耐鹽能力和保水能力，含水量變化越小，其保水能力和耐鹽能力越強［22］。從實驗數(shù)據(jù)中可以得出，黑麥草幼苗的地上部和地下部的含水量都顯著的下降。而且，根和莖長度都有顯著的降低，且根冠比隨著溶液pH的升高先增后減，反映出堿脅迫對根生長的抑制程度明顯大于對莖生長的抑制程度，表明根對生境周圍的pH值的變化更加敏感。

3.2 鹽堿脅迫對多年生黑麥草幼苗光合作用的抑制

葉綠素是決定植物光合能力的關鍵指標，其含量的變化可以反映出光合生產的變化和脅迫因子對植物的作用程度。楊福等［23］在水稻（Oryza sativa）上發(fā)現(xiàn)非鹽堿土和蘇打鹽堿土中生長的水稻劍葉光合作用日變化的趨勢，顯示鹽堿脅迫使每個時間點的凈光合速率、氣孔導度和細胞間二氧化碳濃度顯著降低，亦表明同一光強下，蘇打鹽堿脅迫是導致植物光合作用下降的主要原因。隨著脅迫強度的增大，作為多年生黑麥草捕獲光能、驅使光合固碳的主要物質——葉綠素含量下降（表2）。在正常條件下，葉綠素與葉綠體蛋白結合的松緊取決于細胞內離子含量。這在蘇打堿脅迫條件下，黑麥草體內的Na＋／K＋升高［24］，多余的鈉離子使葉綠素與葉綠體蛋白結合變松，更多的葉綠素遭到破壞，導致光合作用降低［25］，而影響黑麥草的生長。此外，還可能因為脅迫強度的進一步增加，葉片葉綠體數(shù)目逐漸減少，類囊體松散扭曲、破裂并逐漸解體，所以導致葉綠素含量下降［26］。葉綠素含量的降低阻礙了葉片對碳的吸收和固定，而作為骨架元素碳的減少，又使黑麥草的生物量降低。

3.3 鹽堿脅迫對多年生黑麥草幼苗生理生化反應的影響

因鹽脅迫對一系列代謝活性的滲透方面的影響，最終導致缺水，這種缺水會導致氧化脅迫?；钚匝踝鰹楦邼B透和離子脅迫的副產物，能夠導致膜功能的喪失和細胞死亡［27］。MDA是膜脂過氧化作用的產物之一，它可與膜蛋白結合引起蛋白質分子內和分子間交聯(lián)，蛋白質分子發(fā)生聚合，類囊體膨脹變形、排列順序改變，造成基粒消失等葉綠體超微結構變化［28］。MDA還能使膜透性增大，又可與細胞內的各種成分發(fā)生反應，使膜系統(tǒng)中多種酶的生理功能嚴重損傷，因此，可用MDA含量來代表植物膜脂過氧化的水平，反映植物受傷害的程度。活性氧自由基的過量積累直接導致膜脂過氧化，SOD、POD、CAT都可清除細胞內活性氧自由基，也有研究發(fā)現(xiàn)超氧化物歧化酶是生物體內最重要的保護酶［29，30］。本研究表明，MDA的含量在pH＝8.2時已經有了顯著的增加，表明此環(huán)境下活性氧離子的積累較多。隨著脅迫程度的增強，MDA的含量也隨著增加。一方面，為了清除多余的活性氧，植株的抗氧化酶系統(tǒng)發(fā)生改變致力于維持活性氧的代謝平衡。SOD和POD活性的升高，可以高效地去除細胞內的一些自由基。另一方面，隨著pH的升高和脅迫時間的延長能夠誘導活性氧過多積累，生物體內活性氧的大量積累會造成細胞代謝紊亂，細胞質膜嚴重受損，植株體內MDA水平越來越高，抗氧化酶系統(tǒng)繼續(xù)被激活，試圖通過抗氧化酶活性的升高來清除過多的自由基，但是當自由基積累到一定的量后，膜脂嚴重受損，機體內許多蛋白合成受阻，SOD的基因表達也受到影響，SOD活性開始降低［31］。

干旱、鹽堿、低溫等外界逆境因子實質上是一種體外信號，當植物感知體外信號后，可以引發(fā)一系列的體內信號，進而誘導相關基因表達調控的改變。在長期進化過程中，植物擁有完整的信號網絡用以調節(jié)各種環(huán)境脅迫引起的響應。所以，黑麥草對蘇打堿脅迫的適應性應是一個非常復雜的動態(tài)生理生化過程，其生長指標的變化和生理反應的變化等都是緊密聯(lián)系在一起的，是綜合性的反應，其確切的耐鹽堿機理還有待進一步的研究。而且黑麥草是一種多年生牧草，它的耐堿能力可以逐漸訓練出來。本實驗只是從生長和生理指標方面探討了蘇打堿對黑麥草幼苗的影響，還應進一步探討鹽堿對黑麥草不同生長時期的生理影響。

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