百里香染色體制片優(yōu)化及核型分析

楊寧，談永霞，2，李巧峽，賈凌云，陳錫蓮，劉效瑞

（1.西北師范大學生命科學學院，甘肅 蘭州730070；2.蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州730070；3.定西市旱作農(nóng)業(yè)科研推廣中心，甘肅 定西743000）

百里香（Thymus mongolicus），又名地姜、地椒、麝香草，為唇形科百里香屬植物。百里香的株型奇特低矮，花型小，花色艷麗，且全株芳香，喜涼爽氣候，喜光，稍耐蔭，耐寒耐旱，忌濕，耐貧瘠［1］。百里香屬植物原產(chǎn)于地中海沿岸，全球約有400多個種，廣泛分布在北非、歐洲和亞洲溫帶地區(qū)，經(jīng)濟栽培以南歐最多［2］。我國有11種，2個變種，分布于甘肅、新疆、青海、西藏及黃河流域及以北地區(qū)［3］。百里香屬植物具有分布廣泛、適應性強、種內(nèi)多型性較為普遍等特點，在溫帶干旱半干旱地區(qū)的荒漠化生境的植物群落組成及生態(tài)演替中發(fā)揮著重要的生態(tài)功能［4，5］。作為一種頗具開發(fā)價值的多用途植物，近年來，百里香作為芳香蔬菜、藥用植物、香料作物、蜜源植物、觀賞植被及干旱土壤的水土保持植物被大面積種植［6］。

形態(tài)學分類方法是最基本的植物分類方法，在植物分類研究中一直沿用。但是由于百里香屬植物不同種之間的形態(tài)差異較小，加之近年來國外品種的大量引進，所以，僅以形態(tài)學方法難以提供可靠的分類依據(jù)，亟需采用多種方法來加強百里香屬植物的分類研究［1］。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，分子標記及基因序列的分析方法已被廣泛應用于物種的親緣關(guān)系、遺傳變異及系統(tǒng)演化的研究。由于分子的研究方法是基于染色體上的一段DNA序列，因此其結(jié)果有時不如用染色體組分析法直觀［7］。染色體核型分析技術(shù)能明確識別各個染色體的特征，有助于基因定位的研究，它是細胞遺傳學的一項基本技術(shù)，也是染色體工程、細胞分類學和植物育種學的一個不可缺少的手段。對染色體進行核型分析，不僅有助于了解生物的遺傳組成、遺傳變異規(guī)律和發(fā)育機制，而且對預測鑒定種間雜交和多倍體育種的結(jié)果、了解性別遺傳機理以及基因組數(shù)、物種起源、進化和種族關(guān)系的鑒定都具有重要的參考價值［8，9］。通過對細胞核染色體核型穩(wěn)定特征（染色體的數(shù)目、相對長度、著絲點位置、核型不對稱系數(shù)和隨體的有無等）的分析，可以作為分類指標而被利用。因此，染色體核型分析技術(shù)可為研究生物的系統(tǒng)發(fā)育和親緣關(guān)系提供依據(jù)［10］。

由于百里香屬植物的染色體非常小，為1～2μm，一般較難觀察，所以國內(nèi)外對百里香屬植物染色體數(shù)目、核型分析的研究的相關(guān)報道極少，國內(nèi)僅見權(quán)俊萍等［11］對我國產(chǎn)4種2個變種百里香屬植物進行了染色體數(shù)目及核型分析研究，國外對百里香屬植物的研究較為廣泛和深入，并依據(jù)形態(tài)學差異及地理分布特點等將其分為Micantes，Mastichina，Piperella，Teucrioides，Pseudothymbra，Thymus，Hyphodromi和Serpyllum 等8個組，其中分布于亞洲的種多存在Hyphodromi和Serpyllum組中［12］。然而對我國百里香屬植物染色體的數(shù)目、核型分析方面的特征、染色體數(shù)目在種（變種）間的差異及其在百里香屬所在組等方面的基礎(chǔ)植物學問題仍有許多不清楚。筆者首次對甘肅康樂城郊百里香染色體制片技術(shù)進行了優(yōu)化并對其染色體進行了核型分析，旨在積累其細胞學資料，以期為甘肅地產(chǎn)野生百里香的系統(tǒng)分類、遺傳進化及遺傳育種提供一定的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

采自甘肅康樂縣城郊百里香種子，挑選粒大飽滿的百里香種子放在墊有雙層濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，于2009年11月置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中萌發(fā)。

1.2 方法

百里香幼苗芽尖為材料，選取上午8：00－10：00，每隔15min取材1次，用0.02%秋水仙素處理3h，以確定適宜的取材時間；以0.01%～0.04%秋水仙素附加8－羥基喹啉溶液作為預處理液，處理2～4h，以確定適宜的預處理液，預處理液及處理時間見表1。取預處理后的材料，漂洗2～3次，置于卡諾固定液室溫下固定24h之后，用超純水漂洗固定的材料2～3次，于0.1mol／L HCl中，60℃水浴鍋內(nèi)恒溫分別解離5～25min，確定最適宜的解離時間；45%冰醋酸軟化10min后用清水沖洗3～4次，切取百里香芽尖生長點部分，置于載玻片中央，濾紙吸去多余液體，改良石炭酸品紅染色液分別染色10～80min，常規(guī)方法壓片［13］，之后鏡檢，對分散較好的染色體裝片在100倍顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)下鏡檢并拍照。

表1 預處理液及處理時間Table 1 Reagent and time for pretreatments

核型分析采用李懋學等［14，15］提出的標準進行；根據(jù)Levan等［16］的命名法則，來確定染色體的著絲點位置；染色體核型分類按照Stebbins［17］提出的根據(jù)最長與最短染色體的比值和臂比值，來區(qū)分核型對稱和不對稱程度；染色體相對長度指數(shù)（I.R.L）參考 Kuo［18］提出的方法計算；核型不對稱系數(shù)（As.K）參考 Arano［19］的方法計算。相關(guān)公式為：

2 結(jié)果與分析

2.1 制片

圖1 不同取材時間內(nèi)百里香中期細胞的百分比Fig.1 The percentage of the division cells in mitosis metaphase at different sampling times

上午8：45－9：15是觀察百里香染色體數(shù)目比較好的時期，中期細胞的百分比最高可以達到40%（圖1），其他取樣時間雖然也可以觀察到中期分裂相的細胞，但所占比例較小，不易篩選出分散較好的染色體分裂相。以0.04%秋水仙素和0.002mol／L 8－羥基喹啉等體積混合溶液預處理百里香芽尖2～3h，既發(fā)揮了秋水仙素累積分裂中期相的高效性，又保持了8－羥基喹啉能使染色體清晰，便于觀察的特點（表2）。另外，在60℃，0.1mol／L HCl中解離15min，后用45%冰醋酸軟化10min效果最佳；酸解5及10min由于細胞解離不充分，細胞不易分散，造成許多細胞重疊在一起，內(nèi)部細胞由于接觸不到染液而染色較淺，外部細胞卻由于細胞質(zhì)也著色，對比度低，染色體不容易觀察；酸解20及25min雖然解離比較充分，細胞容易分散，細胞質(zhì)也不易著色，但細胞中的染色體染色太淺而不易觀察，部分細胞由于解離過度而出現(xiàn)破裂，染色體也出現(xiàn)不同程度的破壞，斷裂成片段，影響染色體數(shù)目統(tǒng)計和核型分析（表3）。

2.2 核型分析

2.2.1 染色體數(shù)目 選擇30個染色體分散良好的細胞觀察計數(shù)，其中26個細胞染色體數(shù)目為24條，占計數(shù)總數(shù)的86.7%；4個細胞染色體數(shù)目為26，占計數(shù)總數(shù)的13.3%。根據(jù)核型分析標準化建議［16］，確定百里香染色體數(shù)目為2n＝2x＝24。

2.2.2 染色體相對長度及核型分析 根據(jù)李懋學和陳瑞陽［14］提出的植物核型分析標準，進行百里香染色體核型分析。選擇30個百里香細胞進行染色體計數(shù)，核型取5個細胞的平均值。測量染色體長臂和短臂，計算染色體相對長度、臂比值、染色體相對長度指數(shù)，按照染色體總長度由長至短的順序?qū)θ旧w進行排列和編號（表4，圖2～4）。

實驗結(jié)果可以得出百里香染色體的數(shù)目為2n＝2x＝24，其中第2號和第7號為近中部著絲粒染色體（sm），其余均為中部著絲粒染色體（m）；由長染色體（L）、中長染色體（M2）、中短染色體（M1）和短染色體（S）4種染色體組成。核型公式為2n＝2x＝24＝20m＋4sm，核染色體相對長度在7.07%～13.13%，染色體長度比為1.86，染色體臂比大于2∶1的染色體占8.33%，按照Stebbins［17］的核型分類標準，百里香的核型屬2A型，核型不對稱系數(shù)為59.63%。

表2 不同預處理液的效果比較Table 2 Effects of different reagent for pretreatment

表3 不同解離時間的效果比較Table 3 Effect of different dissociation time

表4 百里香染色體的核型參數(shù)Table 4 Karyotype parameters of chromosome in T.mongolicus

圖2 百里香染色體形態(tài)Fig.2 The chromosome morphology of T.mongolicus

圖3 百里香染色體的核型圖Fig.3 Karyotype of chromosome in T.mongolicus

3 討論

3.1 百里香染色體制片技術(shù)的探究

根據(jù)李懋學等［14，15］提出的植物核型分析標準，確定百里香的染色體屬于小染色體，這給百里香染色體數(shù)目的統(tǒng)計和核型分析帶來很大困難。取材部位、取材時間、預處理液的種類和濃度、預處理時間、酸解的時間及方法、染色時間等都影響實驗的成敗。理論上講，任何時間取樣壓片，都可以從正常生長的根中獲得中期分裂相［20，21］。但是如果分裂相所占的比例很小，核型分析就十分困難。李國珍［22］認為，一般植物細胞染色體的分裂高峰期在上午的8：00－10：00，而董然等［23］在對長白山3種橐吾（Ligulariasibirica）的核型研究中，取材時間為上午10：00，趙振軍［24］在阿拉伯茶（Cathaedulis）細胞的研究中得出細胞集中分裂時間在上午8：30－11：30，閻素麗［25］在對向日葵（Helianthusannus）的核型分析中發(fā)現(xiàn)上午9：30－10：00是取材的最佳時間，而本實驗初步觀察到百里香在上午8：45－9：15間存在分裂高峰期，將近40%的細胞處于分裂中期，有利于篩選分散良好的百里香染色體用于核型分析。

在染色體制片中對材料進行預處理主要是阻斷紡錘體的形成，使細胞分裂終止在中期階段，可提高中期分裂相的出現(xiàn)頻率。由于植物不同物種之間的差異性，不同植物所適合的預處理液一般不同。張永兵等［26］在對甜瓜（Cucumismelo）的核型分析中用對二氯苯和紡線菌酮的混合液預處理甜瓜根尖，獲得了主、次縊痕清晰、分散良好的中期染色體分裂相，張紅梅等［27］在青花菜（Brassicaoleracea）染色體核型分析中得出用0.002mol／L 8－羥基喹啉處理2.5h染色體分散性最好。本實驗確定在百里香染色體制片中以0.04%秋水仙素和0.002mol／L 8－羥基喹啉等體積混合溶液預處理百里香芽尖2～3h，秋水仙素累積分裂中期相最多，結(jié)合8－羥基喹啉又能使染色體更清晰、便于觀察。

圖4 百里香染色體的核型模式圖Fig.4 Karyotype pattern of chromosome in T.mongolicus

3.2 百里香的遺傳分類學探討

國外對百里香屬內(nèi)各組部分種的研究結(jié)果表明，Micantes組染色體為二倍體，染色體數(shù)目為30，Mastichina組的染色體為二倍體和四倍體，染色體數(shù)目有30，58，60，染色體基數(shù)多為15或15的倍數(shù)；Piperella組的染色體為二倍體，基數(shù)為14；Pseudothymbra組的染色體包括有二倍體和四倍體，染色體數(shù)目包括28，30，56，染色體基數(shù)為14，15或相應的倍數(shù)；Thymus組的染色體比較復雜，染色體數(shù)目包括有28，30，54，56，58，基數(shù)多為14，15，27，28，29；Hyphodromi組染色體數(shù)目有26，28，42，54，56，58，60，62，84，90，染色體基數(shù)包括13，14，21及它們的倍數(shù)等等；Serpyllum組同 Hyphodromi組較相似，染色體數(shù)目有24，26，28，30，32，35，52，56，58，84，90，染色體基數(shù)包括12，13，14，21等［11，28］。本實驗結(jié)果表明，甘肅康樂地產(chǎn)野生百里香的染色體為2倍體：2n＝2x，染色體基數(shù)為12，對比國外報道的百里香屬各組的染色體數(shù)目資料，初步比較發(fā)現(xiàn)產(chǎn)自甘肅康樂縣的百里香染色體數(shù)目及形態(tài)特征與百里香屬內(nèi)的Serpyllum組在染色體基數(shù)及數(shù)目方面較為相似。一般認為，核型進化的基本趨勢是由對稱向不對稱發(fā)展的，系統(tǒng)演化上處于比較古老或原始的植物，大多具有較對稱的核型，而不對稱的核型則常見于衍生的、特化的以及比較進化的植物類群中［15］。核型不對稱系數(shù)越接近50%，核型的對稱程度越高，進化程度越原始，對甘肅地產(chǎn)百里香核型不對稱系數(shù)和核型類型分析，百里香的核型不對稱系數(shù)為59.63%，接近于50%，具有較大的對稱性；其核型屬2A型，表明甘肅地產(chǎn)百里香在百里香屬中是相對較為原始的。而權(quán)俊萍等［11］對我國4種、2個亞種百里香屬植物的研究結(jié)果中表明，除百里香種未確定外，其他3種及2個亞種的核型均為2B，說明它們在百里香屬中是比較進化的，這與對甘肅康樂縣地產(chǎn)百里香核型的研究結(jié)果有一定的差異，推測甘肅康樂地產(chǎn)百里香在百里香屬中是比較原始，不能歸屬于上述3種。關(guān)于其在百里香屬內(nèi)的系統(tǒng)地位問題，還需進一步研究，才能作出準確判斷。

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