利用菊芋一步法生產(chǎn)酒精工程菌構(gòu)建的研究

李雪雁，張 維，張秀蘭，李 冰

（蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州730050）

菊芋（Helianthus tuberosus）是菊科向日葵屬中能形成地下塊莖的栽培種，其塊莖中菊粉含量可占其干質(zhì)量的70%以上，且這種植物適應(yīng)性強(qiáng)，產(chǎn)量高，價(jià)格低廉，是一種寶貴的半野生資源，具有極大的開發(fā)利用價(jià)值。菊芋是酒精發(fā)酵的良好糖源，近年來(lái)，有關(guān)利用微生物菊粉酶進(jìn)行菊芋酒精發(fā)酵的報(bào)道［1］相繼出現(xiàn)，但選育高產(chǎn)酒精菌種直接應(yīng)用于生產(chǎn)仍是人們努力的方向。余響華等［2］以K氏酵母、糖化酵母為親本，采用單親滅活原生質(zhì)體融合技術(shù)進(jìn)行屬間融合，構(gòu)建可直接轉(zhuǎn)化淀粉產(chǎn)酒精的菌株。結(jié)果獲得高于92%的形成率和6．5%的再生率，最終獲得一株性狀穩(wěn)定、酒精轉(zhuǎn)化率高的融合子，在含5．0%的可溶性淀粉發(fā)酵液中，酒精度可達(dá)7．0%。本研究通過(guò)設(shè)定合適的原生質(zhì)體制備與融合條件，使釀酒酵母［3］與一種能高產(chǎn)菊粉酶的青霉菌菌株進(jìn)行原生質(zhì)體融合，通過(guò)測(cè)定融合菌株的產(chǎn)菊粉酶能力和產(chǎn)酒精能力，選用各項(xiàng)性能較優(yōu)的融合子作為利用菊芋進(jìn)行酒精發(fā)酵的菌株，旨為生物質(zhì)可再生資源轉(zhuǎn)化生產(chǎn)燃料酒精提供理論依據(jù)和研究資料。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 菌種 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）為蘭州理工大學(xué)生命學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存；青霉菌（Penicillium）為本試驗(yàn)前期工作中篩選所得產(chǎn)菊粉酶的菌株。

1．1．2 培養(yǎng)基

酵母YPD培養(yǎng)基：蛋白胨10g·L－1，葡萄糖20g·L－1，酵母膏10g·L－1。

青霉菌培養(yǎng)基：菊粉40g·L－1，酵母膏5 g·L－1，（NH4）2HPO410g·L－1。

再生培養(yǎng)基：將15%蔗糖（溶透穩(wěn)定劑）加入YPD培養(yǎng)基，成分參見(jiàn)酵母YPD培養(yǎng)基。

融合子酒精發(fā)酵培養(yǎng)基：菊粉90g·L－1，酵母膏5g·L－1，蛋白胨10g·L－1。

1．1．3 試劑 Na2HPO4、檸檬酸、蔗糖、EDTA、β－巰基乙醇、PEG、CaCl2、蝸牛酶、纖維素酶、酒石酸鉀鈉、醋酸鈉、冰醋酸和果糖，試驗(yàn)所涉及藥品均為分析純。

1．2 方法

1．2．1 菌種活化與擴(kuò)大培養(yǎng) 試驗(yàn)中，由于釀酒酵母和青霉菌冷藏了一段時(shí)間，故需對(duì)其活化1～2代。方法為在試管斜面培養(yǎng)基上，28～30℃培養(yǎng)48 h，然后轉(zhuǎn)接入液體搖瓶中（裝量為100mL／500mL三角瓶），28～30℃，200r·min－1振蕩培養(yǎng)。

1．2．2 原生質(zhì)體制備

酵母菌原生質(zhì)體制備

1）離心洗滌、收集細(xì)胞：分別取5mL上述培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的酵母細(xì)胞培養(yǎng)液，3 000r·min－1離心10min，棄上清液，向沉淀的菌體中加入5mL緩沖液，用無(wú)菌接種環(huán)，攪散菌體，振蕩均勻后離心洗滌1次，再用5mL高滲緩沖液離心洗滌1次，收集菌體。

2）酶解脫壁：向收集的菌體中加入3mL脫壁預(yù)處理劑，振蕩均勻，于30℃保溫30min，離心5～10min，棄上清，無(wú)菌水洗滌2次。所用脫壁酶為1．5%蝸牛酶，30 ℃，150r·min－1輕微振蕩，每隔30min取樣鏡檢酶解程度，處理1～2h即可停止酶解處理，加入10%蔗糖溶液低滲沖擊，然后離心5～10min，棄酶液，收集原生質(zhì)體及未酶解細(xì)胞［4－6］。用高滲溶液洗滌，懸浮于原生質(zhì)體保存液。

青霉菌原生質(zhì)體制備：用無(wú)菌接種環(huán)從靜置液體培養(yǎng)的三角瓶中挑出菌膜（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)），置于無(wú)菌的圓底離心管中，用4mL，加入3mL脫壁預(yù)處理劑，稍微振蕩，于30℃保溫30min，離心5～10 min，棄上清，用4mL，去上清液，加入2%纖維素酶和1%蝸牛酶混合酶液共3mL，同時(shí)加入0．1mL 10%β－巰基乙醇，于30℃水浴酶解3h，間或搖動(dòng)。酶解結(jié)束后，2 500r·min－1離心5min，棄酶液，收集原生質(zhì)體及未酶解細(xì)胞［7－8］。

1．2．3 原生質(zhì)體再生 將原生質(zhì)體稀釋適當(dāng)倍數(shù)后涂于再生高滲培養(yǎng)基平板，28℃培養(yǎng)，3～5d后觀察。

1．2．4 原生質(zhì)體融合 取兩親本原生質(zhì)體各1mL，混合于滅菌小試管中，2 500r·min－1離心10min，棄上清液，向上述沉淀菌體中加入2mL促溶劑，輕輕搖勻，32℃水浴保溫30min，取適量，適當(dāng)稀釋后涂布于完全培養(yǎng)基固體平板上，28℃培養(yǎng)3～5d后觀察。

1．2．5 融合子的性能測(cè)定 挑取原生質(zhì)體融合后在以菊粉為唯一碳源的培養(yǎng)基平板上長(zhǎng)出的若干大菌落接種，30℃培養(yǎng)24～48h，后轉(zhuǎn)接于液體完全培養(yǎng)基中。利用其營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記、酶活力的測(cè)定、融合子的酒精發(fā)酵特性、細(xì)胞形態(tài)、體積大小、繁殖速率、發(fā)酵強(qiáng)度等方面的觀察和測(cè)定結(jié)果來(lái)鑒定融合子。

1）融合子菊粉酶活力測(cè)定：菊粉酶的活力分為內(nèi)切酶活力（I）和外切酶活力（S），具體測(cè)定方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)［9］。

2）酒精濃度測(cè)定：取100mL成熟發(fā)酵液到蒸餾瓶中，加入100mL水，混勻后蒸餾。取餾出液100mL。用酒精比重計(jì)測(cè)定餾出液中的酒精濃度［10］，再校正為20℃時(shí)的酒精濃度。

3）糖分利用率與酒精的實(shí)際出率的計(jì)算參考文獻(xiàn)［11］。

2 結(jié)果

2．1 原生質(zhì)體制備條件的選擇

2．1．1 菌齡 原生質(zhì)體的形成與菌齡有很大關(guān)系，本試驗(yàn)選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的酵母細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)時(shí)間控制在12h以內(nèi)。絲狀真菌生長(zhǎng)較慢，18h以后肉眼才能看見(jiàn)菌膜，因此，菌齡控制在24h內(nèi)，以更好地形成原生質(zhì)體。

2．1．2 脫壁條件的選擇 酵母原生質(zhì)體制備一般選用蝸牛酶作為脫壁酶，本試驗(yàn)所采用的蝸牛酶濃度為1．5%，酶解時(shí)間1～2h。絲狀真菌類原生質(zhì)體制備一般選用蝸牛酶，纖維素酶不同濃度的組合酶系，本試驗(yàn)選擇2%纖維素酶加1%蝸牛酶的混合酶液，絲狀真菌所需脫壁時(shí)間較長(zhǎng)，酶解時(shí)間約3h，究其原因可能是菌膜沒(méi)有被搗碎，酶與菌絲體接觸面積小，不利于原生質(zhì)體的釋放。

2．2 原生質(zhì)體的融合及融合子的檢出 采用PEG（MW 6000）促融法，將兩親本等比例混合，PEG濃度為30%，32℃水浴保溫30min。

原生質(zhì)體融合的兩個(gè)親本，其一為可以產(chǎn)生菊粉酶的青霉菌，其二為可以進(jìn)行酒精發(fā)酵的酵母菌，二者融合以后直接采取選擇性培養(yǎng)基鑒定的方法可很容易檢出真正的融合子，挑取原生質(zhì)體融合后長(zhǎng)出的若干大菌落接種在以菊粉為唯一碳源的培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)24～48h。后轉(zhuǎn)接于液體完全培養(yǎng)基中，其融合子的酒精發(fā)酵特性、酶活力測(cè)定、細(xì)胞形態(tài)、體積大小、繁殖速率等方面的觀察和測(cè)定結(jié)果表明，均不同于雙親菌株，因此，可確定為融合子。

2．3 酒精發(fā)酵菌株R8菌落形態(tài) R8菌株在平板上的菌落形態(tài)更接近于酵母菌，只是菌落透明度并不高，同時(shí)沒(méi)有表現(xiàn)出很明顯的青霉菌菌落的形態(tài)（圖1）。

2．4 融合子性能測(cè)定及篩選 通過(guò)對(duì)初步確定的16株融合菌株的進(jìn)一步性能測(cè)定，包括其產(chǎn)菊粉酶的能力、產(chǎn)酒精的能力以及遺傳穩(wěn)定性的研究，最終確定一株利用菊芋發(fā)酵產(chǎn)生酒精的菌株。

圖1 R8菌株平板菌落形態(tài)Fig．1 Morphology of R8strains flat colony

2．4．1 產(chǎn)菊粉酶能力測(cè)定 融合菌株R1、R3、R4、R8、R14產(chǎn)菊粉酶活力均極顯著高于其他各組（P＜0．01）（圖2）。為了能從中篩選出產(chǎn)酒精能力強(qiáng)的發(fā)酵菌種，本研究將產(chǎn)菊粉酶活力相對(duì)較好的融合菌株R1、R3、R4、R10、R11、R14，在進(jìn)一步的產(chǎn)酒精能力試驗(yàn)中都作為考察對(duì)象。

2．4．2 產(chǎn)酒精能力的測(cè)定 菌株R3和R8的產(chǎn)酒精能力均極顯著高于其他各組（P＜0．01），而且酒精得率均為41．16%（圖3），這可能是因?yàn)榫闞3的酒精耐受性比R8好，R8的產(chǎn)酶能力隨發(fā)酵液中酒精濃度的增加而受到抑制。但考慮到R8產(chǎn)菊粉酶活力高于R3，基本確定R8作為后續(xù)酒精發(fā)酵的菌株。測(cè)定誤差，進(jìn)行數(shù)據(jù)描述和分析。

圖2 R1－R16菊粉酶活力測(cè)定結(jié)果Fig．2 Inulinase activity determination results of R1－R16

圖3 融合菌株酒精發(fā)酵得率測(cè)定Fig．3 Alcohol fermentation rate determination of fusion strains

2．4．3 融合子穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果 融合子R8穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果表明，四代以內(nèi)，酒精得率不變，均為41．16%，內(nèi)切酶與外切酶活力有所波動(dòng)，均為無(wú)規(guī)律小范圍波動(dòng)，穩(wěn)定性相對(duì)良好（表1）。最終選擇融合菌株R8作為進(jìn)行后續(xù)發(fā)酵的菌株。

3 結(jié)論

選用適合釀酒酵母和青霉菌的不同原生質(zhì)體制備條件，經(jīng)融合與鑒定，篩選出了16株融合子，分別對(duì)其產(chǎn)菊粉酶和產(chǎn)酒精能力及其三代以上遺傳穩(wěn)定性做了測(cè)定，最終確定最優(yōu)菌株為R8，內(nèi)切酶活力為8．97U·mL－1，外切酶活力為25．09U·mL－1，酒精得率為41．16%，原料糖分利用率為75．52%，穩(wěn)定性良好。

表1 融合子R8穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果Table 1 Stability of fusion R8

利用原生質(zhì)體融合技術(shù)構(gòu)建出一種可以直接利用菊芋為原料來(lái)發(fā)酵產(chǎn)生酒精的菌種，經(jīng)過(guò)初步的性能測(cè)定，篩選出一種產(chǎn)菊粉酶和產(chǎn)酒精能力較優(yōu)的菌株，為進(jìn)一步提高菊芋酒精發(fā)酵的產(chǎn)量有一定的參考意義。

［1］ 李俊俊，唐艷斌，唐湘華．復(fù)合酶在菊芋粉發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇中的應(yīng)用［J］．釀酒科技，2009（3）：65－68．

［2］ 余響華，張華山，李亞芳．原生質(zhì)體融合構(gòu)建直接轉(zhuǎn)化淀粉生產(chǎn)燃料酒精的新型菌株［J］．釀酒科技，2006（5）：25－28．

［3］ 李高揚(yáng)，李建龍，王艷，等．利用高產(chǎn)牧草柳枝稷生產(chǎn)清潔生物質(zhì)能源的研究進(jìn)展［J］．草業(yè)科學(xué)，2008，25（5）：15－21．

［4］ 彭幫柱，岳田利，袁亞宏．酵母菌與原生質(zhì)體融合技術(shù)［J］．西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2004，13（1）：101－103．

［5］ 李英軍，馬曉燕．馬克斯克魯維酵母原生質(zhì)體制備和再生條件的研究［J］．釀酒科技，2006（7）：51－54．

［6］ 俞志敏，欒靜，徐鵬．耐高糖釀酒酵母原生質(zhì)體制備與再生過(guò)程研究［J］．釀酒科技，2008（4）：45－48．

［7］ 甘志波，趙學(xué)慧．黑曲霉AMS－11原生質(zhì)體的制備［J］．湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，1994（3）：32－34．

［8］ 王燕．雙親滅活米曲霉原生質(zhì)體融合中原生質(zhì)體制備的研究［J］．中國(guó)釀造，2007（5）：19－22．

［9］ 王靜，金征宇．黑曲霉產(chǎn)菊粉酶的發(fā)酵條件優(yōu)化及誘變育種［J］．生物技術(shù)，2002，12（3）：42－45．

［10］ 秦耀宗．酒精工藝學(xué)［M］．北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，1998：317－326．

［11］ 諸葛健，王正祥．工業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊(cè)［M］．北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，1994：97－99．