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    不同年齡兔前交叉韌帶切斷后關(guān)節(jié)軟骨變化的研究

    2012-08-20 09:47:20孫立勝
    中國微創(chuàng)外科雜志 2012年7期
    關(guān)鍵詞:膠原月齡軟骨

    儲(chǔ) 淼 孫立勝 蔣 青

    (南京醫(yī)科大學(xué)鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院關(guān)節(jié)中心,南京 210008)

    前交叉韌帶(anterior cruciate ligament,ACL)是膝關(guān)節(jié)內(nèi)的強(qiáng)大韌帶,對(duì)維持膝關(guān)節(jié)的穩(wěn)定至關(guān)重要,通過防止脛骨在股骨上向前移動(dòng)或向后移動(dòng),同時(shí)防止膝關(guān)節(jié)過度伸直,限制內(nèi)、外旋和內(nèi)、外翻活動(dòng),是膝關(guān)節(jié)內(nèi)最容易損傷的韌帶[1,2]。ACL 斷裂后,使平衡能力和本體感覺下降,下肢肌肉的力量和功能也受到影響,使受傷下肢生物力學(xué)改變[3,4],關(guān)節(jié)軟骨壓力傳導(dǎo)紊亂,增加了軟骨磨損,導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退行性改變,最終導(dǎo)致骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[5,6]。本研究以3個(gè)年齡段(6、12、24個(gè)月)新西蘭大白兔為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,通過檢測切除兔膝關(guān)節(jié)ACL后不同時(shí)間關(guān)節(jié)軟骨的損傷程度,在病理學(xué)和含水率2個(gè)方面觀察年齡對(duì)ACL斷裂后軟骨損傷的影響,旨在探討處理不同年齡段患者ACL損傷的最佳方法和時(shí)機(jī),為臨床防止或延緩膝關(guān)節(jié)軟骨退變的發(fā)生、發(fā)展提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 動(dòng)物與分組

    新西蘭大白兔30只(為排除性別差異,統(tǒng)一性別為雄兔)。6、12、24月齡各10只[南京市鼓樓醫(yī)院動(dòng)物中心,SCXK(蘇)2007-0004],按年齡分為A、B、C 3組。相同年齡的10只兔子,再隨機(jī)分為5組,每組2只。設(shè)置5個(gè)時(shí)間點(diǎn),分別為術(shù)后5、10、15、20、25 周。雙側(cè)膝關(guān)節(jié)自身對(duì)照,切斷右膝關(guān)節(jié)ACL,以右側(cè)作為陽性對(duì)照側(cè),左側(cè)膝關(guān)節(jié)僅行膝關(guān)節(jié)切開術(shù),作為假手術(shù)陰性對(duì)照側(cè)。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)于動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

    1.2 方法

    1.2.1 手術(shù)方法 肌肉注射麻醉(30 g/L戊巴比妥,劑量0.03 mg/kg)后,將其固定在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)手術(shù)臺(tái)上。膝部剃毛,碘酒、酒精消毒皮膚,鋪洞巾,嚴(yán)格按無菌操作原則進(jìn)行手術(shù)。右膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)做切口至關(guān)節(jié)腔,切口長約3 cm,將髕骨、髕韌帶推向外側(cè),屈曲膝關(guān)節(jié),暴露ACL,用絲線拉起韌帶完全切斷,逐層縫合切口;同樣方法顯露左膝關(guān)節(jié)腔,但不切斷ACL,作為假手術(shù)陰性對(duì)照。沖洗關(guān)節(jié)腔后,1號(hào)絲線逐層縫合切口。術(shù)后1周所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每天肌注80萬U青霉素預(yù)防感染[7]。分籠飼養(yǎng),每籠1兔,不做固定處理,自由進(jìn)食、活動(dòng),強(qiáng)迫兔子每日活動(dòng)半小時(shí),分2次驅(qū)趕。

    1.2.2 標(biāo)本制作與大體觀察 ①大體觀察:分別于術(shù)后5、10、15、20、25周用空氣栓塞法處死各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)兔,解剖顯微鏡下觀察股骨內(nèi)髁關(guān)節(jié)面軟骨改變,按以下原則評(píng)分[8]:0分:關(guān)節(jié)面光整,色澤如常;1分:關(guān)節(jié)面粗糙,有小的裂隙且色澤灰暗;2分:關(guān)節(jié)面糜爛,軟骨缺損深達(dá)軟骨表、中層:3分:關(guān)節(jié)面潰瘍形成,缺損深達(dá)軟骨深層;4分:軟骨剝脫,軟骨下骨質(zhì)暴露。②軟骨標(biāo)本的制作:手術(shù)取下膝關(guān)節(jié)股骨內(nèi)髁,固定于10%中性福爾馬林液中3 d,15%EDTA脫鈣、依次酒精脫水、二甲苯透明,石蠟包埋,切片。

    1.2.3 Masson染色步驟 常規(guī)脫蠟至蒸餾水洗,蘇木素染5~10 min,流水沖洗。1%鹽酸酒精稍分化,流水沖洗數(shù)分鐘返藍(lán)。麗春紅酸性品紅染液染5~10 min,蒸餾水快速?zèng)_洗。磷鉬酸溶液處理約5 min,不用水洗直接用苯胺藍(lán)染液復(fù)染5 min。1%冰醋酸處理1 min。95%酒精、無水酒精快速脫水。二甲苯透明,中性樹膠封固。在南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所觀察Masson染色玻片。

    1.2.4 軟骨生化檢查 在各時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物后立即取下兩側(cè)脛骨平臺(tái)全層軟骨,用濾紙吸干其表面水分,精確稱取濕重。丙酮脫水后在真空干燥器中室溫下干燥至恒重,精確稱其干重,計(jì)算含水率。

    2 結(jié)果

    2.1 大體觀察評(píng)分結(jié)果

    24月齡組的兔子20周和25周組各有1只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡。觀察股骨內(nèi)髁關(guān)節(jié)面處,ACL切斷陽性側(cè):術(shù)后5周時(shí)6、24月齡兔關(guān)節(jié)面略有粗糙,有小的裂隙且色澤灰暗,12月齡兔可見關(guān)節(jié)面磨損較明顯;術(shù)后10周3組兔滑膜輕度充血增生,關(guān)節(jié)液量少許增多,透明,關(guān)節(jié)軟骨面出現(xiàn)表、中層的軟骨缺損;術(shù)后15周3組兔病變有加重趨勢,滑膜增生明顯,滑液量少但稍混濁逐漸,關(guān)節(jié)面粗糙、軟骨小裂隙增多、色澤灰暗,6、12月齡組有軟骨損傷達(dá)深層;術(shù)后20周軟骨病變更明顯,滑膜部分呈結(jié)節(jié)樣增生,滑液量少但混濁,12月齡組兔軟骨損傷較重,部分軟骨下骨暴露,有少量骨贅形成;術(shù)后25周關(guān)節(jié)面基本糜爛,軟骨缺損可深達(dá)軟骨中、深層,滑膜增生、破壞明顯,6月齡組和12月齡組可見軟骨剝脫,骨質(zhì)暴露,還有部分骨贅形成。與右側(cè)相比,假手術(shù)陰性對(duì)照側(cè)(左側(cè))的關(guān)節(jié)軟骨改變不明顯。表1為不同月齡組術(shù)后不同時(shí)間關(guān)節(jié)軟骨損傷的評(píng)分情況,3組術(shù)后不同時(shí)間軟骨退變有逐漸加重的趨勢,12月齡兔發(fā)展最快,基本每5周就進(jìn)展1級(jí),術(shù)后20周時(shí)已經(jīng)到達(dá)最嚴(yán)重的4級(jí),軟骨磨損嚴(yán)重,已有部分骨贅形成;6月齡兔進(jìn)展稍慢,術(shù)后25周時(shí)到達(dá)4級(jí);24月齡兔進(jìn)展較慢,術(shù)后25周時(shí)仍未到達(dá)4級(jí)。

    表1 關(guān)節(jié)軟骨損傷評(píng)分情況

    2.2 軟骨Masson染色結(jié)果

    圖1 術(shù)后5周從左至右依次為6、12、24月齡兔右側(cè)(陽性對(duì)照側(cè))ACL切斷Masson染色切片 6月齡兔ACL切斷陽性對(duì)照側(cè):軟骨膠原綠染,表層軟骨細(xì)胞密集,表層略有不光整,軟骨細(xì)胞核深染,退變軟骨從潮線升起很多紅色火焰狀的突起使未鈣化軟骨出現(xiàn)紅染。12、24月齡兔ACL切斷陽性對(duì)照側(cè)表現(xiàn)與6月齡兔大致相同,但是從潮線升起使未鈣化軟骨出現(xiàn)紅染的紅色火焰狀突起沒有6月齡明顯 Masson染色 ×40 圖2 術(shù)后10周從左至右依次為6、12、24月齡兔右側(cè)(陽性對(duì)照側(cè))ACL切斷Masson染色切片 6月齡兔ACL切斷陽性對(duì)照側(cè):軟骨膠原綠染,表層不光整明顯;退變軟骨從潮線升起很多紅色火焰狀的突起使未鈣化軟骨出現(xiàn)紅染,較術(shù)后5周時(shí)明顯且范圍廣布,可見軟骨表層纖維化。12、24月齡兔ACL切斷陽性對(duì)照側(cè)表現(xiàn)與6月齡兔大致相同,12月齡兔切片中有較多血管翳從潮線通過,侵蝕破壞關(guān)節(jié)軟骨Masson染色 ×40 圖3 術(shù)后15周從左至右依次為6、12、24月齡兔右側(cè)(陽性對(duì)照側(cè))ACL切斷Masson染色切片 24月齡兔ACL切斷陽性對(duì)照側(cè):軟骨膠原淺綠染,疏松,表層不光整,有裂口,軟骨表層纖維化;6月齡兔軟骨表面出現(xiàn)明顯的缺損;12月齡兔軟骨丟失嚴(yán)重 Masson染色 ×40 圖4 術(shù)后20周時(shí)從左至右依次為6、12、24月齡兔右側(cè)(陽性對(duì)照側(cè))ACL切斷Masson染色切片 24月齡ACL切斷陽性對(duì)照側(cè):軟骨膠原淺綠染,血管翳稍有增多,簇集細(xì)胞出現(xiàn)頻率增加較之15周時(shí)變化略有增加;6月齡與12月齡兔軟骨損傷加重,軟骨纖維化與血管翳增生更為明顯 Masson染色 ×40圖5 術(shù)后25周從左至右依次為6、12、24月齡兔右側(cè)(陽性對(duì)照側(cè))ACL切斷Masson染色切片 24月齡兔ACL切斷陽性對(duì)照側(cè):軟骨膠原淺綠染,疏松且紊亂,潮線模糊不清。6、12月齡兔軟骨損傷更為嚴(yán)重,尤其是12月齡兔,損傷最為嚴(yán)重,軟骨殘余量少,大部分磨損、纖維化,細(xì)胞數(shù)少,鈣化層難以分辨 Masson染色 ×40

    ①術(shù)后5周時(shí)關(guān)節(jié)軟骨Masson染色結(jié)果見圖1。6月齡兔ACL切斷陽性對(duì)照側(cè):軟骨膠原綠染,表層軟骨細(xì)胞密集,表層略有不光整 ,軟骨細(xì)胞核深染,退變軟骨從潮線升起很多紅色火焰狀的突起使未鈣化軟骨出現(xiàn)紅染。12、24月齡兔ACL切斷陽性對(duì)照側(cè)表現(xiàn)與6月齡兔大致相同,但是從潮線升起使未鈣化軟骨出現(xiàn)紅染的紅色火焰狀突起沒有6月齡兔明顯。②術(shù)后10周時(shí)關(guān)節(jié)軟骨Masson染色結(jié)果見圖2。6月齡兔ACL切斷陽性對(duì)照側(cè):軟骨膠原綠染,表層不光整明顯;退變軟骨從潮線升起很多紅色火焰狀的突起使未鈣化軟骨出現(xiàn)紅染,較5周時(shí)明顯且范圍廣布,可見軟骨表層纖維化。12、24月齡兔ACL切斷陽性對(duì)照側(cè)表現(xiàn)與6月齡兔大致相同,12月齡兔切片中有較多血管翳從潮線通過,侵蝕破壞關(guān)節(jié)軟骨。③術(shù)后15周時(shí)關(guān)節(jié)軟骨Masson染色結(jié)果見圖3。24月齡兔ACL切斷陽性對(duì)照側(cè):軟骨膠原淺綠染,疏松,表層不光整,有裂口,軟骨表層纖維化:6月齡兔軟骨表面出現(xiàn)明顯的缺損;12月齡兔軟骨丟失嚴(yán)重。④術(shù)后20周時(shí)關(guān)節(jié)軟骨Masson染色結(jié)果見圖4。24月齡ACL切斷陽性對(duì)照側(cè):軟骨膠原淺綠染,血管翳稍有增多,簇集細(xì)胞出現(xiàn)頻率增加較之15周時(shí)變化略有增加;6月齡與12月齡兔軟骨損傷加重,軟骨纖維化與血管翳增生更為明顯。⑤術(shù)后25周時(shí)關(guān)節(jié)軟骨Masson染色結(jié)果見圖5。24月齡兔ACL切斷陽性對(duì)照側(cè):軟骨膠原淺綠染,疏松且紊亂,潮線模糊不清。6、12月齡兔軟骨損傷更為嚴(yán)重,尤其是12月齡兔,損傷最為嚴(yán)重,軟骨殘余量少,大部分磨損、纖維化,細(xì)胞數(shù)少,鈣化層難以分辨。

    2.3 含水率的測定

    3組各時(shí)間點(diǎn)軟骨含水率見表2。ACL切斷的右側(cè)軟骨含水率基本上比左側(cè)高,隨著軟骨損傷從輕到重的發(fā)展,右側(cè)(ACL切斷,陽性對(duì)照側(cè))軟骨含水率呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。6、12月齡組兔軟骨損傷速度較快,所以在10~15周時(shí)出現(xiàn)含水率從高點(diǎn)下降的趨勢,而24月齡兔軟骨損傷慢,在20~25周時(shí)才出現(xiàn)。

    表2 不同年齡組ACL切斷術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)左、右兩側(cè)軟骨含水率 %

    3 討論

    ACL損傷多發(fā)生在處于非功能位的膝關(guān)節(jié),大部分發(fā)生在足球、籃球、滑雪等運(yùn)動(dòng)中,當(dāng)人體在進(jìn)行急停、扭轉(zhuǎn)、落地或者剪切運(yùn)動(dòng)時(shí)。當(dāng)膝關(guān)節(jié)由屈曲40°主動(dòng)伸至完全伸直時(shí),脛骨過度內(nèi)旋時(shí),膝關(guān)節(jié)過度外翻及內(nèi)翻時(shí),ACL承受最高的負(fù)荷[9]。ACL損傷后,膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)定而導(dǎo)致的關(guān)節(jié)軟骨繼發(fā)性損傷,尤以關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)間隙的股骨內(nèi)髁負(fù)重區(qū)處極易出現(xiàn)軟骨磨損,主要是因?yàn)橄リP(guān)節(jié)不穩(wěn)定,ACL防止膝關(guān)節(jié)內(nèi)旋作用消失,運(yùn)動(dòng)時(shí)關(guān)節(jié)的應(yīng)力中心改變,脛股關(guān)節(jié)面出現(xiàn)剪力作用[10,11]。膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)定,嚴(yán)重影響關(guān)節(jié)功能,導(dǎo)致活動(dòng)能力降低,生活也受到影響[12,13],而且長期以往增加了患膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的風(fēng)險(xiǎn)[14]。軟骨損傷主要還受到年齡因素的影響,不同年齡段,在發(fā)生ACL斷裂后,軟骨損傷的程度會(huì)不一樣。

    本研究通過對(duì)6、12、24個(gè)月3個(gè)不同年齡組的新西蘭大白兔進(jìn)行研究,比較不同年齡兔ACL斷裂后的軟骨損傷情況。不論是從大體的觀察、評(píng)分,還是從Masson染色病理切片的觀察,隨著時(shí)間的推移,3個(gè)年齡段的兔軟骨損傷有明顯不同的變化。12月齡兔子軟骨損傷最重,到術(shù)后25周時(shí)已經(jīng)有骨關(guān)節(jié)炎的表現(xiàn);6月齡兔次之,24月齡兔軟骨損傷進(jìn)展最慢,磨損最輕。6月齡兔因?yàn)槟贻p,自身軟骨有較強(qiáng)的修復(fù)作用,如果時(shí)間繼續(xù)延長,肯定會(huì)到達(dá)最嚴(yán)重的軟骨破壞,導(dǎo)致嚴(yán)重骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。ACL是膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定的重要結(jié)構(gòu),損傷后導(dǎo)致股骨、脛骨在負(fù)重時(shí)易半脫位,使膝關(guān)節(jié)不穩(wěn),造成膝關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)面間接觸面積及壓力改變,致半月板和軟骨損傷。半月板損傷后,其對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用轉(zhuǎn)變?yōu)榧羟泻湍p作用,使軟骨發(fā)生軟化、龜裂、剝離、脫落,受到破壞的軟骨對(duì)半月板也會(huì)產(chǎn)生一些損害作用,形成惡性循環(huán),時(shí)間越長,軟骨損傷越嚴(yán)重[9,15,16]。ACL 損傷致關(guān)節(jié)不穩(wěn)定,軟骨受力不均勻,易誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞生理性的改變,甚至發(fā)生凋亡,從組織學(xué)上可見膠原纖維、蛋白多糖減少。在關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)中因磨損會(huì)產(chǎn)生一些微小顆粒,引起關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜反應(yīng),使關(guān)節(jié)液中出現(xiàn)腫瘤壞死因子和白細(xì)胞介素,加劇了軟骨的損傷[17~20]。

    關(guān)節(jié)軟骨由軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成。軟骨基質(zhì)主要包括膠原纖維、蛋白多糖和水,三者的有機(jī)結(jié)合使關(guān)節(jié)軟骨具有承受負(fù)荷,抵抗應(yīng)力、張力及減少摩擦的作用,水在其中所占的比例最大。關(guān)節(jié)軟骨中的水有利于營養(yǎng)和廢物的彌散、交換。本研究結(jié)果顯示在每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn),ACL切斷陽性對(duì)照側(cè)軟骨含水率比陰性對(duì)照側(cè)高,而且在3個(gè)年齡組中,隨著軟骨損傷從輕到重的發(fā)展,ACL切斷陽性對(duì)照側(cè)軟骨含水率呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。軟骨中的水分為游離水和結(jié)合水兩部分,游離水主要由關(guān)節(jié)腔滲透進(jìn)入,滲透壓的大小與蛋白多糖的數(shù)量有關(guān);后者與膠原或蛋白多糖內(nèi)靠著兩者之間的水合作用結(jié)合[21]。在軟骨破壞較輕階段,一方面由于軟骨結(jié)構(gòu)的破壞,導(dǎo)致膠原纖維結(jié)構(gòu)改變,膠原蛋白含量下降,這些結(jié)構(gòu)的改變導(dǎo)致軟骨腫脹,增加了滲透壓,從而導(dǎo)致高滲吸水,引起滲透壓的持續(xù)增大,含水率的增加[22]。隨著軟骨磨損的越來越嚴(yán)重,由于新合成的蛋白多糖分子量較小,導(dǎo)致蛋白多糖與膠原生物學(xué)性能降低,同時(shí)炎癥介質(zhì)釋放減少,組織腫脹減輕,水合作用降低,含水率逐漸減小。含水率這一特點(diǎn)也可以使之成為檢測軟骨損傷程度的指標(biāo)。陰性對(duì)照側(cè)的膝關(guān)節(jié)軟骨也有輕度改變,可能是因?yàn)樵搨?cè)進(jìn)行了關(guān)節(jié)切開手術(shù),手術(shù)造成出血、損傷、積血,各種因素激發(fā)的炎癥反應(yīng)引起了關(guān)節(jié)軟骨應(yīng)激反應(yīng)[23]。

    本研究使用新西蘭兔作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,兔膝關(guān)節(jié)的結(jié)構(gòu)組成、負(fù)重情況、生物力學(xué)和人有較大差別,而且本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量有限,無法得出完全肯定的結(jié)論,但本實(shí)驗(yàn)顯示的膝關(guān)節(jié)軟骨損傷和年齡的關(guān)系與人可能有一定的共性,可供臨床參考。

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