LC-MS法測定擬南芥原生質(zhì)體脫落酸的研究

郭 磊，Mohammed Humayun KABIR，童建華，黃志剛，蕭浪濤

(湖南農(nóng)業(yè)大學植物激素與生長發(fā)育湖南省重點實驗室，長沙410128)

脫落酸(ABA)參與了植物的種子萌發(fā)、氣孔運動、開花、結(jié)果和衰老等多個生長發(fā)育進程并在逆境應答系統(tǒng)中起著重要的作用［1-2］．很多ABA缺陷或抗性突變體種子不休眠或發(fā)生胎萌，多個ABA超敏感的擬南芥突變體種子休眠程度加強，表明ABA是一種重要的內(nèi)源萌發(fā)抑制劑，許多種子成熟期間有2個ABA積累高峰期［1］．脫落酸在植物的逆境信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)中起著重要的作用［3］．水稻在水分脅迫狀態(tài)下，根源ABA是植物體內(nèi)ABA的主要來源，可能是植物體在逆境情況下根系感受逆境信息而產(chǎn)生的一種向地上部傳遞的逆境信號［4］．因此，準確測定脫落酸的含量對于深入闡明脫落酸介導的發(fā)育過程和逆境應答等有關機制十分必要和迫切．

傳統(tǒng)植物激素檢測方法主要有放射免疫法、酶聯(lián)免疫法、氣相色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等［5-7］．這些檢測方法通常是以植物組織為測定對象，但存在一定局限性．首先植物組織中的大量木質(zhì)素、纖維素、蠟質(zhì)、角質(zhì)等成分，均是構(gòu)成材料鮮重或干重的一部分，但在不同植物組織和器官中的含量不一致，以原生質(zhì)體數(shù)量代替植物組織質(zhì)量對植物激素進行衡量在統(tǒng)計方法上具有一定特色．其次，從植物組織中提取植物激素時需要較多的前處理步驟，不僅影響了測定的速度，且增加了潛在的誤差［8］．采用原生質(zhì)體作為測定材料可以在一定程度上減少這些問題．利用纖維素酶、離析酶酶解細胞壁得到原生質(zhì)體［9-10］，通過對原生質(zhì)體的離心純化，已除去了不少影響植物激素檢測靈敏度的物質(zhì)，用這種材料作為植物激素檢測的對象，可以降低誤差、提高植物激素測定的精確度和靈敏度．本文以原生質(zhì)體為材料，研究了采用LC-MS法測定擬南芥原生質(zhì)體的脫落酸，避免了細胞間隙中的復雜化學組成干擾，提高了植物激素測定的靈敏度和精度，完善了經(jīng)典的植物激素測定技術．

1 材料與方法

1．1 試驗材料及培養(yǎng)

試驗材料:擬南芥(Arabidopsis thaliana L．)哥倫比亞生態(tài)型(Col-0)．土培擬南芥的培養(yǎng)條件:擬南芥Col-0種子消毒、春化后，播種于混合土(m(營養(yǎng)土)∶m(蛭石)∶m(沙子)=1∶1∶1)中，生長 30 d 左右(光照周期為16 h光照/8 h黑暗，溫度為22℃，濕度為70%)，取蓮座葉用于葉片原生質(zhì)體的制備(圖1A)．液體MS培養(yǎng)擬南芥條件:擬南芥Col-0種子消毒、春化后，播種于MS固體培養(yǎng)基上(光照周期為16 h光照/8 h黑暗，溫度為22℃，濕度為70%)，生長7 d后轉(zhuǎn)入MS液體培養(yǎng)基在搖床上(30 r/min)進行無菌培養(yǎng)8～10 d，取根系用于原生質(zhì)體的制備(圖1B)．

1．2 試驗方法

1．2．1 主要儀器和試劑 主要儀器包括 Waters Acquity-SQD液質(zhì)聯(lián)用儀，Olympus BX51熒光顯微鏡，Jouan RCT-60真空冷凍離心濃縮系統(tǒng)．主要有纖維素酶R-10、離析酶R-10(Yacult Honsha Co．，Tokyo，Japan)，ABA 標準品(HPLC 級，美國 SIGMA公司，純度大于98%)、乙腈、甲醇、甲酸(色譜純，美國TEDIA公司)．

圖1 在液體MS培養(yǎng)基(A)和營養(yǎng)土(B)上培養(yǎng)得到的擬南芥Figure 1 Arabidopsis cultivated in solid MSmedium(A)，liquid MSmedium(B)and soil

1．2．2 擬南芥原生質(zhì)體的制備 酶解液配方:1．5% 纖維素酶 R-10，0．4% 離析酶 R-10，20 mmol/L;KCl，20 mmol/L MES(pH 5．7)，0．1%BSA，0．4 mol/L 甘露醇，10 mmol/L CaCl2，0．45 μm濾膜過濾后，KOH校正pH為5．7．

WI溶液配方:0．5 mol/L 甘露醇，20 mmol/L KCl，4 mmol/L MES(pH 5．7)，0．45 μm 濾膜過濾后，KOH校正pH 為5．7．

葉片原生質(zhì)體的制備:將葉片縱向切成1～2 mm寬的細條，置于酶解液中．25℃恒溫搖床上50 r/min游離4 h．酶解液通過74μm細胞篩網(wǎng)過濾后，將濾液4℃、60 r/min離心1 min，取沉淀懸浮于WI溶液中，重復洗滌3次，利用血球計數(shù)板計算原生質(zhì)體數(shù)量，4℃ 100 r/min離心5 min后去掉上清，得到葉片原生質(zhì)體樣品用于脫落酸的提取和測定．

根系原生質(zhì)體的制備:將根系用手術剪縱向切碎，置于酶解液中，25℃恒溫搖床上50 r/min震蕩4 h，進行原生質(zhì)體的游離．將酶解液通過74μm細胞篩網(wǎng)過濾后，將擬南芥根系原生質(zhì)體濾液4℃、200 r/min離心1 min，取沉淀懸浮于WI溶液中，重復洗滌3次，通過血球計數(shù)板計算原生質(zhì)體數(shù)量，4℃、200 r/min離心5 min后去掉上清，得到根系原生質(zhì)體樣品用于脫落酸的提取和測定．

1．2．3 脫落酸的提取與測定 將原生質(zhì)體樣品用液氮反復凍融破碎細胞;加入700μL 80%預冷的甲醇，充分混勻后，置于4℃中浸提15 h以上;4℃，16 000 r/min離心10 min后取上清;于殘渣中加入500μL 80%預冷的甲醇重復浸提2次，每次浸提4 h;離心后合并3次上清液，置于冷凍濃縮機中濃縮至干．將濃縮干的樣品溶解于20μL 10%甲醇進行LC-MS分析．

脫落酸的測定條件:(1)液相色譜條件:色譜分析柱為 Acquity UPLC? BEH C18，100 ×2．1 mm，1．7 μm;以甲醇和水梯度為流動相洗脫，起始體積分數(shù)為10%的甲醇，2 min后甲醇體積分數(shù)變?yōu)?00%;流速0．25 mL/min;柱溫35 ℃．(2)質(zhì)譜條件:采用SIR測定模式;負離子;錐孔電壓30 V;毛細管電壓3．0 kV;離子源溫度120℃;脫溶劑溫度350℃;脫溶劑氣流速600 L/h;反吹氣流速50 L/h;m/z(263．2)．

2 結(jié)果與分析

通過Olympus BX51熒光顯微鏡對擬南芥葉片和根系原生質(zhì)體進行觀察，發(fā)現(xiàn)經(jīng)酶解游離后得到了較純凈的原生質(zhì)體(圖2)．

圖2 擬南芥葉片原生質(zhì)體(A)和擬南芥根系原生質(zhì)體(B)Figure 2 Protoplasts of Arabidopsis leaves(A)and protoplasts of Arabidopsis roots(B)

LC-MS測得的ABA的峰型較好(圖3)，得到的ABA數(shù)據(jù)較精確．通過ABA標準品制作的標準曲線，用外標峰面積法測定得到了不同數(shù)量土培擬南芥葉片原生質(zhì)體和液體MS培養(yǎng)擬南芥根系原生質(zhì)體的ABA含量(圖4)及土培擬南芥葉片原生質(zhì)體和液體MS培養(yǎng)擬南芥根系原生質(zhì)體的ABA含量與原生質(zhì)體數(shù)目之間的線性方程，相關系數(shù)分別為0．992 3，0．993 1(表 1)，線性關系較好．原生質(zhì)體ABA的檢測下限由樣品中的ABA含量和檢測儀器的靈敏度決定．Waters Acquity-SQD液質(zhì)聯(lián)用儀對ABA溶液的檢測下限為1．07 ng/mL．土培擬南芥葉片原生質(zhì)體和MS液體培養(yǎng)擬南芥根系原生質(zhì)體的ABA含量的檢測下限分別為3萬和2萬個．液體MS培養(yǎng)的擬南芥處于無菌環(huán)境下，受到高濕、水脅迫，密閉環(huán)境等影響，故其ABA含量較高．

圖3 ABA標準品(A)與樣品(B)LC-MS圖譜Figure 3 LC-MS of ABA standard(A)and sample(B)

圖4 土培擬南芥葉片原生質(zhì)體(A)和水培根系原生質(zhì)體(B)ABA含量與原生質(zhì)體數(shù)量的線性圖Figure 4 Linear relationship between ABA content and number of protoplasts

表1 LC-MS測得的擬南芥原生質(zhì)體ABA含量與原生質(zhì)體數(shù)量之間的線性方程和相關系數(shù)Table 1 Linear equation and correlation coefficient between protoplasts numbers and the ABA content determined by LC-MS

3 討論與結(jié)論

本試驗通過高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用，建立了提取并快速定量擬南芥根系和葉片分離的原生質(zhì)體脫落酸含量的方法．通過Waters Acquity-SQD液質(zhì)聯(lián)用儀測得的ABA樣品的峰型較好，所測ABA數(shù)據(jù)較精確，原生質(zhì)體的ABA含量與原生質(zhì)體數(shù)目之間的線性關系較好．原生質(zhì)體的檢測下限主要由儀器的靈敏度和細胞中植物激素水平?jīng)Q定．

但利用原生質(zhì)體測定植物激素也面臨著一些問題．通過原生質(zhì)體測定植物激素對研究人員的操作要求較高．原生質(zhì)體容易破碎，所以移取時，要選取口徑適中的移液槍槍頭，操作要輕柔．原生質(zhì)體離心后要快速去上清并重新加入溶液重懸，否則原生質(zhì)體容易堆積，影響原生質(zhì)體的計數(shù)．在遮光條件下對原生質(zhì)體進行操作，在一定程度上減少原生質(zhì)體的破碎而影響試驗結(jié)果．在原生質(zhì)體制備過程中植物激素降解等情況有待進一步的研究確定．

本實驗以原生質(zhì)體數(shù)量代替植物組織質(zhì)量對植物激素進行衡量，在統(tǒng)計方法上具有一定特色．利用原生質(zhì)體測定植物激素可以減少復雜化學組份的干擾，簡化了前處理步驟，降低了誤差，從而提高植物激素測定的靈敏度和精確度．今后可在提取ABA時在樣品中加入同位素標記的ABA標準品，在試驗的每一步測定回收率，改進提取方法，以實現(xiàn)更精確的測定．

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