Nell-1在骨組織工程中的應用及與疾病關系的研究進展

李 利，李力韜，郭喬楠 (第三軍醫(yī)大學:.學員旅7隊;.西南醫(yī)院病理學研究所，重慶 400038)

Nell-1(neural epidermal growth factor-like 1)基因定位于染色體11p15.1-p15.2，是一種新型生長因子，具有誘導成骨細胞分化、促進骨組織礦化，最終促進新骨質(zhì)形成的作用。Nell-1作為潛在的新型成骨基因，有更強的安全性和特異性，可能在骨組織工程中發(fā)揮作用并且有良好的開發(fā)應用前景。此外，也有研究顯示Nell-1基因在大腸癌及Burkitt’s淋巴瘤中有異常表達?；贜ell-1在成骨細胞分化和凋亡過程中發(fā)揮的調(diào)節(jié)作用，推斷Nell-1的促進成骨細胞分化及抑制成骨細胞增殖作用在骨肉瘤等骨組織腫瘤中可能扮演抑癌基因角色。

1 Nell-1基因及其編碼蛋白的特點

Nell-1首先由Watanabe等［1］分離自人胎兒腦cDNA，它們編碼包含6個表皮生長因子(EGF)樣區(qū)域，Nell-1基因定位于染色體11p15.1-p15.2，Nell-1 的 cDNA 長度為2 977 bp，包含編碼810個氨基酸的開放性閱讀框架(ORF)，大鼠和人的序列具有93%的同源性。

Nell-1基因編碼一個90 kDa的多肽，其分泌蛋白以三聚體的形式存在(分子量約400 kDa)。Nell-1蛋白包含1個疏水的N末端信號肽、1個 NH2端血小板反應蛋白-1(thrombospondin-1，TSP-1)樣模序、1個卷曲螺旋區(qū)、5個血管假性血友病因子C結(jié)構(gòu)域和6個EGF樣結(jié)構(gòu)域。TSP-1作用于不同的受體、細胞因子、蛋白酶及胞外分子(如潛伏狀態(tài)TGFβ1等)，在細胞的粘附、遷移和增殖過程中起作用。TSP-1能在細胞外結(jié)合并活化處于潛伏狀態(tài)的TGFβ1，而TGFβ1是破骨細胞生成及神經(jīng)嵴細胞分化的一個負調(diào)節(jié)蛋白，提示Nell-1也可能在胞外活化TGFβ1超家族成員并產(chǎn)生相似作用。另外，有學者對Nell-1蛋白的EGF樣結(jié)構(gòu)域進行了研究，結(jié)果顯示Nell-1蛋白在細胞內(nèi)通過EGF結(jié)構(gòu)與蛋白激酶CβⅠ(PKCβⅠ)結(jié)合并被其磷酸化，Nell-1的EGF樣結(jié)構(gòu)域與PKC都對碘氧基苯甲醚有特異性作用。據(jù)此他們提出Nell-1的EGF樣區(qū)域可能作為PKC調(diào)節(jié)多個信號通路的靶點，參與細胞生長、分化、腫瘤發(fā)生及凋亡等胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導途徑的假設。

2 Nell-1在成骨方面的調(diào)控作用

2.1 Nell-1促成骨細胞分化與骨形成

顱縫早閉，是人類常見的先天顱面畸形的一種，發(fā)病率為1/2 500～1/3 000個嬰兒。Watanabe等［1］最早于人腦和腎臟組織中檢測到Nell-1極其微弱的表達，后發(fā)現(xiàn)Nell-1在顱面部骨組織中優(yōu)先表達，并且在顱縫早閉(CS)患者的顱縫周圍組織中發(fā)現(xiàn)Nell-1過度表達。有研究證實Nell-1轉(zhuǎn)基因小鼠過早關閉的顱縫中有多種骨性聯(lián)結(jié)表型，且Nell-1在成骨細胞中過表達明顯促進了堿性磷酸酶和微結(jié)節(jié)形成，進而促進了成骨細胞的分化和礦化，而當Nell-1表達下調(diào)時體外成骨細胞的分化受到抑制。這些均提示Nell-1可能在顱縫閉合過程中扮演局部調(diào)節(jié)因子的作用。還有研究在Nell-1缺乏的小鼠模型中觀察到長骨及椎體的成骨缺陷，提示Nell-1在脊柱及外周骨的成骨過程中也發(fā)揮著成骨作用。此外，Nell-1還可通過體外作用于多種細胞，促進大型或小型哺乳動物骨的形成［2-4］。

Desai等［5］利用N-乙烷-N-亞硝基脲誘導新生小鼠 Nell-1基因點突變獲得Nell-1(6R)突變小鼠，Nell-1(6R)基因含有一個T-A堿基替換使編碼半胱氨酸的密碼子轉(zhuǎn)換成一個過早的終止密碼子［Cys(502)Ter］，使大部分基因編碼的具有促進成骨、成軟骨細胞間的黏附和細胞間通訊以及維持組織結(jié)構(gòu)強度和彈性的細胞外基質(zhì)(ECM)，如特異型膠原、凝血酶敏感蛋白和腱蛋白等明顯下降，最終導致小鼠的軟骨異常、脊柱彎曲度異常、胸廓異常和頭顱形態(tài)異常。說明Nell-1基因具有誘導成骨細胞分化、促進骨組織礦化，最終促進新骨質(zhì)形成的作用。如果Nell-1基因的表達降低，成骨作用亦會受到抑制。

胡鏡宙等［6］國內(nèi)學者對Nell-1基因在體外骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化做了研究，他們利用腺病毒轉(zhuǎn)染大鼠脛骨和股骨骨髓后分未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染β-半乳糖苷酶(β-Galactosidase，LacZ)基因的LacZ組以及轉(zhuǎn)染Nell-1基因的Nell-1組三個組。他們選用ALP作為BMSCs向成骨細胞分化的一個重要指標，結(jié)果顯示Nell-1組的ALP含量明顯高于另外兩組，證實了轉(zhuǎn)染Nell-1基因組可以提高骨髓間充質(zhì)干細胞的ALP活性。另外，因骨C-羧基谷氨酸蛋白(bone C-glutamicacid-containing protein，BGP/OC)是一個高度特異性的成骨分化蛋白，其表達呈現(xiàn)發(fā)育階段特異性，在細胞結(jié)節(jié)形成時開始表達，基質(zhì)礦化時達到最高水平，他們將OC作為評估成骨細胞外基質(zhì)礦化的指標，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染Nell-1基因組OC的表達和鈣結(jié)節(jié)形成均明顯高于另外兩組，證實了Nell-1基因有促進BMSCs向成骨細胞分化的特性?？傊琋ell-1基因具有促進BMSCs向成骨細胞分化及促進細胞外基質(zhì)礦化進而推進骨形成的作用。

2.2 Nell-1促成骨細胞凋亡與骨形成關系

2.2.1 Fas/Fas-L路徑與Nell-1促成骨細胞凋亡關系 有研究提到Fas途徑在正常成骨細胞凋亡中起重要作用，在S252W FGFR2 Apert顱縫早閉和尖頭并指畸形綜合征Ⅲ型TWIST單倍不足中Tnf和Fas途徑參與了成骨細胞的凋亡。有報道稱Nell-1是通過PKC路徑發(fā)出信號誘導成骨細胞的凋亡，而激活的PKC會誘導 Fas-L基因的轉(zhuǎn)錄［7］。Zhang等［8］觀察了出生12.5 d和15.5 d的Nell-1轉(zhuǎn)基因小鼠的顱蓋、膨出的腦組織及軟顱骨中有Fas和/或Fas-L的上調(diào)，由此證實了Fas調(diào)節(jié)的路徑是顱蓋成骨細胞和腦組織的一個主要的凋亡路徑。在這條路徑中，F(xiàn)as-L激活了Fas受體從而啟動一系列信號級聯(lián)放大，包括Fas相關死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(FADD)、受體干擾蛋白(RIP)或Fas死亡結(jié)構(gòu)域相關蛋白(DAXX)并最終導致細胞的死亡。成骨細胞的凋亡在分化晚期開始增加，隨后在礦化階段明顯增加，這說明Nell-1基因通過Fas/Fas-L路徑只針對處于合適條件下的成骨細胞誘導凋亡且在成骨細胞分化的不同階段可能扮演著不同的角色。此外，有數(shù)據(jù)顯示當Nell-1表達適度上調(diào)時會加速成骨細胞分化以及顱縫早閉，而大量的Nell-1的過表達會誘導凋亡增加以及神經(jīng)管缺陷，如無顱蓋。說明Nell-1過表達在顱骨發(fā)育過程中誘導了中樞神經(jīng)細胞的異常調(diào)節(jié)，從而導致了顱面發(fā)育的畸形或神經(jīng)管缺陷，而這些也許是由于凋亡增加使得礦化減少、細胞遷移受到破壞?？傊現(xiàn)as/Fas-L參與Nell-1誘導成骨細胞凋亡為神經(jīng)管缺陷的發(fā)生機制以及人類的顱面異常提供了一種新的思路。

2.2.2 APR3 與 Nell-1 促成骨細胞凋亡關系 Zou 等［9］利用Nell-1作為誘餌篩選出凋亡相關蛋白3(APR3)作為Nell-1結(jié)合蛋白調(diào)節(jié)細胞內(nèi)信號傳導通路。APR3首先在全反式維甲酸(ATRA)治療的HL-60細胞中成功克隆，是一種抑制增殖的膜蛋白，并誘導細胞分化和凋亡。APR3過表達會阻斷G1/S期使得細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)啟動子活性顯著降低，減少Cyclin D1在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達。他們通過共聚焦顯微鏡首次發(fā)現(xiàn)了APR3在人類骨肉瘤細胞株Saos2和U2OS細胞以及在非腫瘤細胞株COS-7和293T細胞中分布在核膜上并通過免疫沉淀反應證實了APR3與Nell-1共同分布在核膜上且直接與Nell-1蛋白結(jié)合。這些成為APR3結(jié)合NELL-1作為促進成骨細胞分化同時抑制細胞增殖的一個潛在的機制。

2.3 Nell-1對成骨細胞成骨的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機制

2.3.1 Nell-1 與轉(zhuǎn)錄因子 Runx2/Cbfa1 關系 Runt相關轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2/Cbfa1)對于成骨是必不可少的。Runx2促進下游成骨細胞基因如a1型膠原(Col1-a1)、骨唾液蛋白(Bsp)，骨橋蛋白(Op)和骨鈣素(Ocn)等基因的轉(zhuǎn)錄是通過結(jié)合到他們的啟動子區(qū)域的成骨細胞特異性結(jié)合元素2(OSE2)。Truong等［10］研究發(fā)現(xiàn)在Nell-1基因的5＇側(cè)翼區(qū)轉(zhuǎn)錄起點上游2.2 kb內(nèi)767、972和1 600 bp位置上共識別3個成骨細胞特異性結(jié)合元件2(OSE2)位點，Runx2基因通過與這3個OSE2結(jié)合激活了人Nell-1基因啟動子使得Nell-1基因表達上調(diào)。然而，將這3個OSE2位點分布被突變并隨表達Runx2的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到骨肉瘤Sao2細胞中。Sao2細胞的核提取物同3個位點探針結(jié)合成復合物后，Nell-1啟動子的活性卻顯著降低了，說明Runx2基因在成骨細胞分化過程中起著總開關的作用。這些結(jié)果表明Nell-1可能是Runx2的一個下游調(diào)控靶點。間充質(zhì)干細胞(MSC)分化為骨祖細胞需要Runx2的激活，Zhang等［11］將Nell-1(CMV-Nell-1)過表達轉(zhuǎn)基因小鼠與單倍體不足的Runx2(Runx2+/-)小鼠雜交配種后治愈了后者的部分顱蓋缺損，即Nell-1蛋白在Runx2+/-顱蓋移植體中誘導了礦化和骨形成，然而在Runx2-/-卻沒有出現(xiàn)此現(xiàn)象，推測Nell-1不僅是Runx2的一個下游靶點，也可能與Runx2在成骨方面具有協(xié)同作用。

2.3.2 Nell-1與促絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)信號通路的關系 周海華等［12］曾探討了促絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路在Nell-1介導成骨細胞分化中的作用。JNK激酶通路參與成骨細胞分化增殖的信號轉(zhuǎn)導，并且在應急、程序性細胞死亡、骨質(zhì)代謝和炎癥中發(fā)揮重要作用。ECM蛋白能夠與TSP-1等相互作用間接激活Ras-MAPK級聯(lián)反應，再通過Runx2蛋白實現(xiàn)向成骨細胞的分化。他們根據(jù)人Nell-1與TSP-1結(jié)構(gòu)域的相似性推斷Nell-1也可能通過該路徑調(diào)控成骨細胞的分化。

3 Nell-1應用于骨組織工程研究進展

在正常情況下，成骨細胞主要是合成和向細胞外分泌各種細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，促進這些ECM沉積并最終形成致密的骨組織結(jié)構(gòu)。骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)作為骨移植替代物是目前應用最廣泛的成骨生長因子，但BMP-2在骨誘導方面存在多種副作用如促脂肪形成［13］、腫瘤形成等。另外，多數(shù)顱面缺損目前需采取骨移植或外科修補方法，自體骨移植作為治療顱面缺損的常用手段，存在手術(shù)致畸和自體骨有限等問題。因此，隨著骨組織工程技術(shù)的逐漸成熟，開發(fā)劑量可控性、對機體的副作用小以及臨床可操作性強的新型促進骨形成的生長因子成為研究的熱點。Aghaloo等［14］將 Nell-1蛋白植入鼠顱蓋缺損部位顯示Nell-1誘導骨再生的能力與BMP-2相當，而Nell-1促進細胞的礦化只針對具有成骨潛能的細胞，說明Nell-1相比BMPs的成骨作用方面在安全性和組織特異性方面更勝一籌。前面提到的Nell-1基因能誘導BMSC向成骨細胞分化并促進骨形成，使得Nell-1具備了成為骨組織工程生長因子的基本條件。此外，骨組織工程生長因子的研究趨向于多生長因子的聯(lián)合應用，有報道稱Nell-1和BMP-2基因聯(lián)合應用于骨組織工程，可以更好地促進組織工程骨的形成［15］。骨延長術(shù)(DO)被公認為一種延長骨的有效技術(shù)，但治療周期長、結(jié)合纖維或骨折不愈合限制了它的臨床應用。Zhu等［16］將48只兔子的單側(cè)脛骨延長7天后隨機分為4組，分別在延長端給予標準磷酸鹽緩沖液、50μg rhNell-1、50μg rhBMP-2、25μg rhBMP-2 和 25μg rhNell-1，結(jié)果顯示重組人骨形成蛋白2(rhBMP-2)與NELL-1分子聯(lián)合治療組的骨密度、骨礦含量、骨小梁厚度最高且骨小梁間隔最小，證實BMP-2和Nell-1聯(lián)合應用增強了彼此的功效，從而明顯地促進了骨愈合，同時Nell-1能夠減少BMP作為成骨生長因子相關的副作用［2］，Aaron等［13］通過研究認為 Nell-1可以逆轉(zhuǎn)大劑量BMP-2的促脂肪形成的作用?？傊?，Nell-1與BMP-2聯(lián)合治療能夠產(chǎn)生組織修復量增加、更好的組織特性及促進愈合的效果，二者聯(lián)合應用可能縮短治療周期和促進骨延長術(shù)后療效，特別是針對那些因為年齡增長、骨質(zhì)疏松癥和腫瘤輻照后成骨能力下降的患者，為骨組織工程臨床治療提供了一個更好的思路。

除了Nell-1的成骨作用及對抗BMP-2相關副作用外，若要應用于臨床治療，還需要具備合適的載體和劑量可控性。目前利用軟骨生長因子促進軟骨修復和軟骨再生的軟骨組織工程是整形和外科重建多用的方法。Nell-1是一種新型生長因子被認為具有軟骨細胞系靶細胞特異性。Lee等［17］將兔軟骨細胞置于三維立體藻酸鹽水凝膠微環(huán)境中培養(yǎng)，采用殼聚糖:TPP︰CHS按5︰1︰1的比例將Nell-1包被在殼聚糖微粒中持續(xù)釋放Nell-1，結(jié)果顯示包被了Nell-1的治療組軟骨細胞增殖和集落的形成明顯增多且含有更多的II型膠原和粘多糖。說明Nell-1具有促進軟骨細胞增殖和細胞外基質(zhì)軟骨特異性沉積的功能。通過封裝或吸附到釋放系統(tǒng)來釋放DNA、多肽和蛋白質(zhì)等分子已被廣泛應用。DBX是一個商業(yè)上用于骨移植的脫鈣骨基質(zhì)(DBM)和透明質(zhì)酸鈉(作為DBX載體)的混合物。b-TCP，因其生物相容性和骨傳導性通常被作為臨床骨替代物的材料，目前已被廣泛用作局部傳遞BMP-2的載體，在體內(nèi)b-TCP與透明質(zhì)酸或膠原蛋白相比具有相對較慢的(4～6周)吸收速度，這樣延長了蛋白質(zhì)傳遞時間使蛋白質(zhì)充分發(fā)揮生物效應。Li等［18］將Nell-1蛋白加載到大小為200～300 mm b-TCP微粒上，并將其與DBX混合，結(jié)果顯示植入了2.5 mg或5.0 mg含有Nell-1載體的動物超過75%在術(shù)后4周擁有了堅固的脊柱融合。相比之下，植入不含Nell載體的動物有75%融合失敗。實驗結(jié)果說明Nell-1這個新型的生長因子被凍干加入到b-TCP微粒并與DBX混合后顯著提高了大鼠的脊柱融合率。在安全的前提下，這種材料可能作為傳遞Nell-1蛋白質(zhì)的骨移植材料應用于臨床的脊椎融合和其他骨組織工程中，從而提高人類脊柱融合率和病人生活質(zhì)量。

4 Nell-1與疾病的關系及展望

有人發(fā)現(xiàn)Nell-1在人類所有正常造血細胞中檢測不到成熟的Nell-1 mRNA，而唯一的在前B細胞發(fā)育過程中的一定階段可檢測到未成熟的、未經(jīng)剪切的Nell-1 mRNA。為部分前B細胞白血病提供一種可能的診斷標記。啟動子的超甲基化所引發(fā)的基因沉默是癌發(fā)生機制中的一個中心事件。Mori等［19］發(fā)現(xiàn)Nell-1在結(jié)腸癌中作為新的啟動子甲基化位點之一，可能扮演潛在的腫瘤抑制基因角色。近年來，研究基因異常與骨腫瘤的發(fā)生及癌細胞生物學行為的關系已是當今研究熱點之一，原癌基因激活和抑癌基因失活是部分腫瘤發(fā)生的關鍵。骨肉瘤是原發(fā)性骨腫瘤中最常見的惡性腫瘤。由于Nell-1對成骨細胞的分化、凋亡有促進作用，并且抑制成骨細胞增殖，提示Nell-1可能在骨肉瘤等骨組織腫瘤中扮演抑癌基因的角色。所以，觀察Nell-1基因在骨肉瘤組織以及瘤細胞中的表達水平，闡明Nell-1的抑癌作用并進一步探索其作用機制將是一項有意義的研究。

［1］Watanabe TK，Katagiri T，Suzuki M，et al.Cloning and characterization of two novel human cDNAs(NELL1 and NELL2)encoding proteins with six EGF-like repeats［J］.Genomics，1996，38(3):273 －276.

［2］Siu RK，Lu SS，Li W，et al.Nell-1 Protein Promotes Bone Formation in a Sheep Spinal Fusion Model［J］.Tissue-Eng-Part-A，2011，17(7-8):1123－35.

［3］Cowan CM，Cheng S，Ting K，et al.Nell-1 induced bone formation within the distracted intermaxillary suture［J］.Bone，2006.38(1):48 －58

［4］Li W，Zara JN，Siu RK，et al.Nell-1 enhances bone regeneration in a rat critical-sized femoral segmental defect model［J］.Plast-Reconstr-Surg，2011，127(2):580 －587.

［5］Desai J，Shannon ME，Johnson MD，et al.Nell1-deficient mice have reduced expression of extracellular matrix proteins causing cranial and vertebral defects［J］.Human Molecular Genetics，2006，15(8):1329 －1341.

［6］胡鏡宙，蔣欣泉，張志愿，等.Nell-1型分子基因?qū)Υ笫蠊撬杌|(zhì)細胞成骨分化的影響［J］.中國口腔頜面外科雜志，2009，7(1)38－43.

［7］Hay E，Lemonnier J，F(xiàn)romigue O，et al.Bone morphogenetic protein-2 promotes osteoblast apoptosis through a Smad-independent protein kinase C-dependent signaling pathway［J］.J Biol Chem，2001，276:29028－29036.

［8］Zhang X，Cowan CM，Jiang X，et al.Nell-1 induces acrania-like cranioskeletal deformities during mouse embryonic development.Lab Invest.2006 Jul;86(7):633 －644.

［9］Zou X，Shen J，Chen F，et al.NELL-1 binds to APR3 affecting human osteoblast proliferation and differentiation［J］.FEBS Letters，2011，585(15):2401－2418.

［10］Truong T，Zhang X，Pathmanathan D，et al.Craniosynostosis-associat-ed gene nell-1 is regulated by runx2［J］.J Bone Miner Res，2007，22(1):7－18.

［11］Zhang X，Ting K，Bessette CM，et al.Nell-1，a Key Functional Mediator of Runx2，Partially Rescues Calvarial Defects in Runx2 +/-Mice［J］.J-Bone-Miner-Res，2011，26(4):777 －791.

［12］周海華，李祖兵.Nel樣1型分子對成骨細胞分化的分子調(diào)控機制［J］.國際口腔醫(yī)學雜志，2010，37(2):166 －169.

［13］Aaron W.James，Angel Pan，Michael Chiang，et al.A new function of Nell-1 protein in repressing adipogenic differentiation［J］.Biochemical and Biophy-sical Research Communications，2011，411(1):126 －131.

［14］Aghaloo T，Cowan CM，Chou YF，et al.Nell-1-induced bone regeneration in calvarial defects［J］.Am J Pathol.2006 Sep.169(3):903 －915.

［15］Cowan CM，Jiang X，Hsu T，et al.Synergistic effects of Nell-1 and BMP-2 on the osteogenic differentiation of myoblasts［J］.J Bone Miner Res，2007，22(6):918 －930.

［16］Zhu SS，Song DH，Jiang XW，et al.Combined effects of recombinant human BMP-2 and Nell-1 on bone regeneration in rapid distraction osteogenesis of rabbit tibia［J］.Injury，42(12):1467 －1473.

［17］Lee M ，Siu RK ，Ting K ，et al.Effect of Nell-1 Delivery on Chondrocyte Proliferation and Cartilaginous Extracellular Matrix Deposition［J］.Tissue-Eng-Part-A，2010，16(5):1791 －1800.

［18］Li W，Lee M，Whang J，et al.Delivery of Lyophilized Nell-1 in a Rat Spinal Fusion Model［J］.Tissue-Eng-Part-A，2010，16(9):2861 －2870.

［19］Mori Y，Cai K，Cheng Y，et al.A Genome-Wide Search Identifies Epigenetic Silencing of Somatostatin［J］.Tachykinin-1，and 5 Other Genes in Colon Cancer［J］.Gastro-enterology，2006，131(3):797 －808.