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    多肽分子長效研究進展

    2012-08-15 00:53:20李小華
    重慶理工大學學報(自然科學) 2012年11期
    關(guān)鍵詞:化學修飾免疫原性半衰期

    姜 和,李小華

    (1.重慶理工大學 藥學與生物學院,重慶 400054;

    2.重慶前沿生物技術(shù)有限公司,重慶 400041)

    多肽藥物是生物技術(shù)新藥的主要品種之一。多肽藥物具有活性高、療效穩(wěn)定、用量少、毒副作用小等優(yōu)點,對自身免疫疾病、癌癥、心血管疾病、高血壓、精神失常等疾病有顯著的療效,且應用范圍廣泛,因此備受國內(nèi)外研究者的關(guān)注。隨著醫(yī)療科學的日益發(fā)展,多肽類藥物已成為21世紀最重要的診斷、預防和治療藥物。但是,多肽分子進入體內(nèi)后會很快被降解,這是由于人體內(nèi)含有大量的蛋白酶,能降解多肽分子,使多肽迅速喪失活性。同時由于腎小球的過濾作用和肝臟的代謝作用,多肽很快被清除,使多肽分子在體內(nèi)表現(xiàn)出半衰期短、穩(wěn)定性差、生物活性弱等性狀。為了維持多肽分子的藥效,就需要加大給藥頻度和劑量,而長期反復注射給藥不僅給患者增添了痛苦和經(jīng)濟負擔,還會導致各種副作用的產(chǎn)生。因此在藥學領(lǐng)域迫切需要研發(fā)長效的多肽分子。

    體內(nèi)致多肽分子短效的因素[1]主要有:① 多肽分子進入體循環(huán)系統(tǒng),蛋白水解酶使多肽分子降解為小分子肽或者氨基酸。②多肽分子發(fā)生物理或化學上的變化。物理變化包括沉淀、聚集等作用,化學變化包括氧化作用、還原作用、水解作用、脫酰胺反應、糖基修飾等。同時多肽分子周圍的環(huán)境也會對多肽的穩(wěn)定性造成一定的影響。③通常較大分子量的多肽通過受體介導的方式來清除,受體介導清除機制可能是一種主要的清除機制。受體介導的清除的限速步驟是藥物與細胞表面受體形成非共價鍵的過程。受體清除具有細胞特異性。④不同的給藥途徑對多肽藥物的體內(nèi)分布、代謝過程、生物利用度和藥理作用都有十分顯著的影響。目前,延長多肽分子長效的技術(shù)主要有4種:對多肽分子進行化學修飾;把多肽分子與白蛋白進行基因融合;引入抗蛋白酶突變體到多肽分子上;研究多肽分子的長效緩控釋制劑。

    1 化學修飾

    對多肽分子進行化學修飾是一種改變多肽分子主鏈結(jié)構(gòu)或側(cè)鏈基團的重要手段,同時還可以改變多肽分子的理化性質(zhì)。據(jù)相關(guān)文獻[2-4]報道,經(jīng)過化學修飾的多肽分子能顯著降低其免疫原性、降低毒副作用、增加水溶性、延長半衰期、增加療效和生物利用度?;瘜W修飾是延長多肽半衰期的一個有效途徑,是多肽分子長效的重要技術(shù)手段之一。當前,在多肽分子長效化中最主要的化學修飾方法有PEG修飾、糖基修飾和定點突變。

    1.1 PEG 修飾

    聚乙二醇是由環(huán)氧乙烷聚合而成,呈中性,無毒,具有良好的生物相容性,也是經(jīng)過FDA批準的極少數(shù)能作為體內(nèi)注射劑藥用的聚合物之一。聚乙二醇具有高度的親水性和極好的水溶性,并且沒有免疫原性。當聚乙二醇偶聯(lián)到藥物表面時,會把它的優(yōu)良特性賦予藥物分子,減少藥物的酶降解,避免腎臟代謝,并使藥物能被免疫系統(tǒng)的細胞識別。聚乙二醇修飾藥物的相對分子質(zhì)量和注射給藥方式會影響它的藥代動力性質(zhì),一般分子量越大,半衰期越長。通過聚乙二醇修飾技術(shù)對多肽進行適合生理應用的改造具有以下優(yōu)點[5]:半衰期更長,注射頻率減小,血藥濃度波動小,最大血藥濃度較低,毒性較小,免疫原性較小,溶解性更好,治療費用更低等。多肽的聚乙二醇修飾技術(shù)具有廣闊的應用前景,已經(jīng)成為藥物化學研究的重點和熱點之一。

    PEG修飾多肽藥物時必須考慮以下幾點:首先,PEG修飾物不僅僅是聚乙二醇的聚合物,還可以是聚乙二醇聚合物的一系列衍生物。在選擇PEG時必須考慮其對藥物生物活性和藥代動力學方面的影響,通常采用相對分子質(zhì)量 40 000~60 000的高分子PEG作為多肽的PEG修飾劑[6]。多肽分子在體內(nèi)的作用時間與偶聯(lián)的PEG數(shù)量和相對分子量成正比,在體外的生物活性與偶聯(lián)的PEG數(shù)量和相對分子量成反比。其次,PEG修飾多肽分子的位點應根據(jù)多肽藥物的構(gòu)效關(guān)系進行選擇,應選擇不與受體結(jié)合的多肽表面殘基進行修飾,這樣修飾的多肽能保持較高的生物活性。

    在腫瘤化療過程中,人體內(nèi)的中性細胞減少是一種具有潛在危險的不良現(xiàn)象,經(jīng)常導致化療時間的延長,影響腫瘤化療的療效。重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)是一種多肽細胞因子,是防治腫瘤化療所致中性細胞減少的有效多肽藥物[7],可以選擇性地作用于粒系造血祖細胞,促進其增值、分化,降低化療后因骨髓功能抑制所感染的發(fā)生率,保證化療順利進行。rhG-CSF已經(jīng)廣泛應用于臨床,但是其半衰期很短,在一個化療周期中需要連續(xù)多次給藥,這不但給治療帶來不便,還增加了患者的生理痛苦。由重慶富進生物醫(yī)藥有限公司研制的聚乙二醇化重組人粒細胞集落刺激因子(PEG-G-CSF)[8]是將重組人粒細胞集落刺激因子經(jīng)單甲氧基聚乙二醇化學修飾后制成的制劑,具有半衰期長,腎臟清除率慢,免疫原性低等優(yōu)點。經(jīng)PEG修飾后的rhG-CSF的半衰期可達到46~62 h,給藥頻率變?yōu)?個化療周期只需用藥1次。

    由于尿酸及其鹽類在血漿中具有溶解度低、容易沉積的缺陷,會使血漿中尿酸的濃度顯著升高,形成高尿酸血癥。尿酸酶是一種新型的降尿酸多肽藥物,可以促進尿酸分解,對關(guān)節(jié)性痛風、尿結(jié)石及腎功能衰竭所致的高尿酸血癥有良效。但尿酸酶是一種外源性蛋白,直接使用會增加其免疫原性,容易產(chǎn)生過敏反應。采用靜脈注射的方式將尿酸酶注射到小鼠體內(nèi)時發(fā)現(xiàn),尿素酶的穩(wěn)定性差,半衰期短,并產(chǎn)生很強的免疫原性。才蕾等[9]用聚乙二醇(PEG)對尿酸酶進行修飾,發(fā)現(xiàn)經(jīng)PEG化的尿素酶在小鼠體內(nèi)的半衰期由原來的45 min延長到696 min。由此可見,經(jīng)修飾后的尿素酶的穩(wěn)定性顯著提高,免疫原性明顯降低。

    1.2 糖基修飾

    糖基化修飾是蛋白質(zhì)翻譯后修飾中最主要的一種手段,對生命體活動起著非常重要的作用。多肽的糖基化修飾能影響多肽的藥代動力學作用、生物活性、藥物穩(wěn)定性、對蛋白酶的易感性、水溶性、免疫原性和凝聚性等,是延長多肽半衰期的重要手段之一。

    促紅細胞生成素(EPO)是由腎臟和肝臟分泌的一種激素樣多肽,能促進紅細胞增生,主要用于治療貧血性疾病。EPO本身就是一種高度糖基化的酸性糖蛋白,由165個氨基酸組成,含有3個N-糖鏈和一個O-糖鏈。Amgen公司的 Elliott等[10]科學家研制了一種新型的促紅細胞生成素(NESP),在EPO的33位和88位的N-糖鏈處各增加了一個糖基化修飾。研究表明,EPO經(jīng)糖基化修飾后,多肽藥物的活性不變 ,半衰期明顯延長,是EPO的3倍,從而達到了減少給藥頻率和延長藥效的目的。

    恩夫韋肽(T-20)是由瑞士羅氏公司和美國Trimeris公司聯(lián)合開發(fā)的由36個氨基酸組成的抗艾滋病多肽藥物。T-20在治療HIV-1感染患者時表現(xiàn)出良好的療效。然而,把T-20應用于臨床時發(fā)現(xiàn)它的半衰期僅為2 h左右。由于T-20半衰期短的限制,臨床上就必須采用每天注射2次的給藥頻率來彌補其缺陷。這種頻繁給藥的方式給艾滋病患者帶來極大的生理痛苦,還會在注射部位出現(xiàn)青腫、囊腫、瘙癢、痛疼、潮紅等副作用。Thierry Huet等[11]通過糖基修飾技術(shù),用戊多糖(CP)對T-20(enfuvirtide)進行修飾,再用PEG作為CP和enfuvirtide的連接橋梁,最終形成了enfuvirtide-PEG12-CP(EP40111)。通過藥代動力學研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)糖基化的恩夫韋肽(EP40111)在人體內(nèi)的半衰期可達120 h,注射頻率由原來的每天2次變?yōu)槊恐?次。并且,糖基化的恩夫韋肽能彌補T-20抑制劑可溶性低的缺陷,減少對注射部位的副作用。

    1.3 定點突變

    多肽的定點突變是通過對多肽分子的1個或者多個氨基酸進行改變(創(chuàng)造一系列多肽類似物),從而達到延長多肽半衰期的一種方法。多肽的定點突變是利用寡核苷酸引物、PCR介導的定點基因突變等方法使多肽分子中影響活性或者穩(wěn)定性的氨基酸發(fā)生突變,從而增加多肽的穩(wěn)定性、生物活性和延長半衰期。

    天然的白介素-2(IL-2)是一個由133個氨基酸殘基組成的多肽,是機體免疫調(diào)節(jié)的核心物質(zhì),與其他細胞因子共同完成機體免疫功能的平衡調(diào)節(jié)。IL-2一般用于肝炎、癌癥等疾病的治療,并取得了一定的成果[12]。但大劑量、長期的頻繁給藥和發(fā)熱、惡心、嘔吐等副作用給患者帶來很大的困擾,因此改造IL-2的結(jié)構(gòu),使其成為具有高活性、低毒性、長效性新型藥物勢在必行。呈游離狀態(tài)的Cys-125易形成錯配的二硫鍵配對或形成分子間的二聚體,影響了IL-2的穩(wěn)定性和生物活性。據(jù)報道[13],科學家利用定點突變的技術(shù),將IL-2的125位Cys突變?yōu)锳la,18位的Leu突變?yōu)镸et,19位的Leu突變?yōu)镾er,提高了天然IL-2的穩(wěn)定性和生物活性。結(jié)果顯示,IL-2進行定點突變后,活性比天然的IL-2提高了1倍,體內(nèi)的半衰期由原來的幾分鐘提高到1.2 h。

    為了得到長效的多肽藥物,在實際運用中往往采用幾種修飾相結(jié)合的方法對多肽分子進行修飾。對促紅細胞生成素(EPO)的長效修飾,不僅可以采用糖基修飾的方法,還可采用糖基修飾和定點突變相結(jié)合的方法。Sinclair等[14]采用定點突變技術(shù),將EPO中的30位、32位、87位、88位和90位氨基酸進行改變;采用糖基修飾技術(shù),在EPO的30位和88位增加了寡糖鏈,從而使其分子質(zhì)量由原來的30 kDa增加到50 kDa。采用了定點突變和糖基修飾后的EPO,在慢性腎臟衰竭病人的臨床試驗中,發(fā)現(xiàn)其半衰期由原來的4~13 h延長到 27 ~89 h[15]。

    2 基因融合

    基因融合技術(shù)能增加多肽分子的分子量,改變多肽與受體的親和性,從而達到延長藥物半衰期的效果?;蛉诤夏軜?gòu)建多功能目的蛋白,它是將2個或者多個基因的編碼區(qū)首尾連接,由同一個調(diào)控序列控制基因表達的產(chǎn)物。這種基因融合的技術(shù)具有簡單靈活的特點,可廣泛應用于構(gòu)建生物活性分子,并且基因融合技術(shù)的應用不會受生物分子大小和活性的限制。在多肽的基因融合中,通常選用分子量較大、半衰期較長的分子作為載體構(gòu)建融合蛋白,應用最廣泛的分子載體是人血清白蛋白(HSA)[16-18]。人血清白蛋白是現(xiàn)有的天然載體蛋白之一,它是人體血漿的主要組成部分,在體內(nèi)參與維持血漿滲透壓和運輸營養(yǎng)物質(zhì),具有人體相容性好、分子量大、半衰期長和無免疫原性等功能。HAS是藥物設計的理想載體蛋白,用于改善藥物的半衰期,延遲藥物的清除,減少注射頻率,改善病人對治療的順從性和耐受性。

    GLP-1(胰高糖素樣肽-1)是一種由人腸細胞分泌的內(nèi)生成多肽,它能促進胰島素的分泌,是一種治療2型糖尿病的多肽藥物。人體內(nèi)存在一種二肽基酶(DPP-IV),這種酶幾乎存在于人體的所有組織和器官中,它能使人體的大部分激素多肽失活。當GLP-1進入人體后,它會迅速被DPP-IV降解,并且在2 min內(nèi)幾乎被完全降解。這就意味著GLP-1的半衰期非常短暫,只有2 min左右。Roger Leger等[19]通過化學修飾改變了GLP-1(被DPP-IV酶切)的酶切位點,使GLP-1不能被DPP-IV識別,并且通過對GLP-1的C端的馬來酰亞胺修飾,得到了GLP-1的類似物。當GLP-1的類似物進入人體后,能快速與人血清白蛋白融合,生成基因融合物(GLP-1-HSA)。在鼠的試驗中,GLP-1-HSA的半衰期顯著延長,穩(wěn)定性增加,生物活性增強。

    在臨床應用中,常規(guī)多肽分子通常受到半衰期短和具有潛在免疫原性的限制,使多肽分子藥物的給藥頻率過高。FB006M[20]是由重慶前沿生物有限公司生產(chǎn)的一種多肽,它是由38個氨基酸組成的HIV-1病毒融合抑制劑,用于治療艾滋病。發(fā)明者對FB006M的13位Lys進行了一個特殊的馬來酰亞胺酸修飾,此特殊位點的修飾使FB006M進入人體后,能快速與人血清白蛋白(HSA)按照1∶1的分子比共價結(jié)合,形成的結(jié)合物為FB006M-HSA。據(jù)相關(guān)文獻[20]報道,在臨床試驗中,F(xiàn)B006M-HAS表現(xiàn)出半衰期長、治療方便性高、治療費用低、毒副作用小等特性,從而使艾滋病患者的生活質(zhì)量得到改善。

    纖溶酶原是一種最新發(fā)現(xiàn)的血管生成抑制蛋白,具有明顯的血管生成抑制作用。纖溶酶原的結(jié)構(gòu)由5個環(huán)組成,其中每個單環(huán)和多環(huán)的獨立結(jié)構(gòu)均有抗腫瘤細胞遷移和抑制腫瘤細胞增殖的作用。在纖溶酶原的5個環(huán)中,5號環(huán)(K5)抗腫瘤細胞遷移的能力最強,但K5進入人體內(nèi)后,易被腸激酶降解,導致了其半衰期短。據(jù)相關(guān)文獻報道[21],K5經(jīng)馬來酰亞胺酸修飾后,進入體內(nèi)能與人血清白蛋白的34位Cys結(jié)合,形成一種基因融合產(chǎn)物K5-HSA。研究發(fā)現(xiàn),K5-HSA在體內(nèi)的半衰期明顯延長,腎臟清除率明顯降低,生物活性非常高,還能抵御酶的降解。

    3 抗蛋白酶突變體

    多肽分子的穩(wěn)定性是決定多肽藥物是否長效的重要因素。多肽分子很容易被血漿或組織中的蛋白酶分解,這種分解作用直接導致了多肽藥物的半衰期短,生物利用度低和血漿清除率快,并且蛋白酶對多肽的降解作用發(fā)生在吸收、分布、排泄等各個階段。為了防止多肽被蛋白酶降解,將,1個或多個抗蛋白酶降解突變體引入具有生物活性的多肽分子上,從而提高多肽穩(wěn)定性,此方法成為了多肽藥物設計和發(fā)展的研究焦點。

    T淋巴細胞表位肽在體內(nèi)非常容易被亮氨酸氨肽酶降解。為了提高T淋巴細胞表位肽抵抗亮氨酸氨肽酶降解的能力,Marschutz M K等[22]對T淋巴細胞表位肽進行了N端甲基化修飾,引入了抗蛋白酶突變體。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),在相同的條件下,經(jīng)修飾的肽90%未被亮氨酸氨肽酶降解,而未經(jīng)修飾的肽50%未被降解。結(jié)果表明,引入抗蛋白酶突變體的T淋巴細胞肽的穩(wěn)定性和半衰期都強于未經(jīng)修飾的T淋巴細胞肽。

    4 緩控釋制劑

    延長多肽分子半衰期的方法除了前面提到的化學修飾和基因融合的方法以外,還可以通過緩釋或控釋的方法對多肽分子進行長效修飾。此方法是在注射液中加入高分子聚合物,提高藥物黏度,延緩藥物的擴散速度,如水凝膠,納米膠囊,微球等;或?qū)⒍嚯姆肿影谥|(zhì)體中,讓多肽藥物從脂質(zhì)體中緩慢地釋放出來;或?qū)⒍嚯姆肿影裨诠腆w微粒中,讓多肽分子從微粒中緩慢釋放出來。通常,采用緩控釋給藥可以減少藥物的給藥次數(shù),穩(wěn)定患者體內(nèi)的血藥濃度,延長作用時間,增強療效和增加藥物的長效性。多肽藥物的緩控釋技術(shù)已經(jīng)成為新型給藥技術(shù)的熱點之一。

    NCHG是一種納米復合材料的生物相容性水凝膠,可用于局部給藥,用于治療牙周感染,它的藥效一般在24 h以內(nèi)。Jozsef Bako[23]等采用緩控釋技術(shù),將NCHG包裹入納米粒子中,形成被納米粒子包裹的水凝膠(NCHGs)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),NCHGs通過溶脹的方式緩慢釋放藥物,使其藥物釋放的周期超過48h,從而達到了增加藥物半衰期、延長藥物療效的目的。

    5 結(jié)束語

    近年來,隨著生物技術(shù)新藥的發(fā)展,多肽分子因具有安全性高、生物活性好的優(yōu)點而成為了研究的熱點,受到國內(nèi)外制藥行業(yè)的廣泛關(guān)注。但多肽分子類藥物在體內(nèi)不穩(wěn)定、易被降解、易被腎臟清除,使得其半衰期普遍較短而必須頻繁給藥,因此研究長效多肽藥物成為了必然的趨勢。目前,多肽分子長效技術(shù)主要有化學修飾、基因融合、抗蛋白酶突變體和緩控釋制劑?;瘜W修飾的長效技術(shù)應用最為廣泛,除了主要的PEG修飾、糖基化修飾、定點突變等,還有C端修飾、N端修飾、側(cè)鏈修飾、環(huán)化等。在所有的多肽長效技術(shù)中,它們之間沒有獨立的界線,各種技術(shù)可以相互穿插,相互滲透。

    在未來多肽分子長效技術(shù)的研究中,可以尋求新的多肽長效手段??梢酝瑫r采用多種長效技術(shù)對同一個多肽分子進行修飾,即采用復合型的長效技術(shù)??梢蚤_發(fā)新型緩控釋制劑的生物降解材料;可以把緩控釋技術(shù)與靶向技術(shù)相結(jié)合,使多肽藥物在長效的同時還能精準定位,致力于研究出更加優(yōu)化更加長效的多肽藥物,為多肽分子長效技術(shù)錦上添花,為廣大病患者造福。

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