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    乳酸脫氫酶A(ldha)基因的克隆與原核表達(dá)

    2012-06-02 09:32:54許香雅沈榕強(qiáng)
    關(guān)鍵詞:乳酸克隆質(zhì)粒

    袁 軍,許香雅,沈榕強(qiáng)

    (福建農(nóng)林大學(xué) a.生命科學(xué)學(xué)院;b.生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福州 350002)

    乳酸脫氫酶(lactate dehydmgenaLse,LDH)是糖代謝中的主要酶類,可催化生物體內(nèi)丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸,也是腫瘤發(fā)生、發(fā)展中Warburg效應(yīng)的重要效應(yīng)酶。Warburg效應(yīng)是指腫瘤在發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中,能量獲得方式由有氧方式轉(zhuǎn)化為無(wú)氧糖酵解方式的現(xiàn)象。在脊椎動(dòng)物體內(nèi),LDH存在3種亞基[1],分別為A(或稱M亞基)、B(或稱H亞基)、C。研究表明,減少ldha基因的表達(dá)能減少細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和顯著地延長(zhǎng)腫瘤的形成時(shí)間,因此,ldha基因在腫瘤的形成初期和腫瘤的發(fā)生過(guò)程中扮演著重要角色[2-3]。ldha基因編碼的LHD-A蛋白是腫瘤相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)控因子HIF-1α及c-Myc的效應(yīng)蛋白,它在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用,由于基因改變和腫瘤低氧癥,許多癌細(xì)胞消耗大量的葡萄糖并且通過(guò)LDH-A生成乳酸。LDH-A表達(dá)水平的變化直接關(guān)聯(lián)著腫瘤的發(fā)展程度[4]。此外,在人體內(nèi)LDH-A同工酶譜的變化也可從一定程度上反映組織器官的病變,對(duì)診斷心腦血管疾病、呼吸道疾病、肝臟疾病、腫瘤等均有重要參考價(jià)值。為了得到LDH-A的純蛋白,以便在腫瘤相關(guān)通路中進(jìn)行LDH-A蛋白水平的檢測(cè),并進(jìn)一步闡明ldha基因作用的分子機(jī)理,本文對(duì)Hela細(xì)胞中的LDH-A蛋白編碼基因進(jìn)行了克隆,并在E.coli中進(jìn)行表達(dá)研究。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株和質(zhì)粒

    本實(shí)驗(yàn)所涉及的菌株見(jiàn)表1,質(zhì)粒見(jiàn)表2。

    表1 本實(shí)驗(yàn)所用到的菌株

    表2 本實(shí)驗(yàn)所用到的質(zhì)粒

    1.1.2 主要試劑

    限制性內(nèi)切酶EcoR I和 HindⅢ、Taq酶、T4-DNA連接酶、卡那霉素(Kan)均購(gòu)自Takara公司。質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物基因科技公司。RNA提取試劑TRIzol Reagent購(gòu)自lnvitrogen公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒均購(gòu)自Tiangen公司。IPTG(異丙基硫代-β-D半乳糖苷)購(gòu)自Sigma公司。丙烯酰胺和N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺為Bio-Rad公司產(chǎn)品。寡核苷酸引物由上海鼎安生物科技有限公司合成。

    1.2 表達(dá)載體pET28a(+)-ldha的構(gòu)建

    參照TRIzol(Invitrogen)說(shuō)明書(shū)的方法提取Hela細(xì)胞中的總RNA。反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA過(guò)程按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。從Genebank獲得ldha基因的全核苷酸序列,使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增ldha基因編碼序列所需的引物,F(xiàn):5’-下劃線部分分別為 EcoR I和HindⅢ的酶切位點(diǎn)。PCR反應(yīng)體系(25 μL)如下:10×EX Taq PCR Buffer 2.5 μL,dNTP(2.5 mmol·L-1)1 μL,引物(20 μmol·L-1)各 0.3 μL,模板 1 μL,EX Taq 酶(2.5 U·μL-1)0.2 μL。PCR 反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min;94℃變性45 s,59℃退火45 s,72℃延伸1.5 min,循環(huán)32次后72℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及質(zhì)粒pET28a(+)經(jīng)純化后,用EcoR I和HindⅢ進(jìn)行雙酶切,然后用T4-DNA連接酶于16℃進(jìn)行連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)。涂布于LB+Kan平板上,37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h,挑取單菌落接種于4 mL LB+Kan培養(yǎng)基中,于 37℃ 180 r·min-1搖床培養(yǎng)16h。挑取陽(yáng)性克隆做PCR及酶切驗(yàn)證。將經(jīng)驗(yàn)證的陽(yáng)性克隆子送公司測(cè)序后與ldha基因原序列進(jìn)行同源性比對(duì)。序列正確的質(zhì)粒即為獲得的表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-ldha。實(shí)驗(yàn)具體操作方法參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》[5]。

    1.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

    挑取經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證的E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-ldha和 E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)單菌落,分別接種于4 mL含卡那霉素(10 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中,37℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。按1%接種量分別將菌體轉(zhuǎn)接于含相應(yīng)抗生素的50 mL LB液體培養(yǎng)基中,37℃恒溫振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6 ~0.8,加 IPTG 至終濃度 1.0 mmol/L,28℃繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)8 h。然后4℃離心1 min(12 000 r·min-1),棄上清留菌體沉淀,再用 80 μL 5×SDS-PAGE樣品緩沖液重懸,放入100℃沸水煮3 ~5 min 后取出,離心5 min(12 000 r·min-1),上清液用于SDS-PAGE分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 ldha基因的克隆

    參照TRIzol說(shuō)明書(shū)的方法獲得了Hela細(xì)胞的總RNA,提取結(jié)果如圖1所示。以RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板,與合成的引物擴(kuò)增得到ldha目的基因片段,大小為999 bp(圖2),與預(yù)期大小相符。

    圖1 Hela細(xì)胞中抽提的總RNA

    2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建與驗(yàn)證

    PCR產(chǎn)物與載體pET28a(+)具有相同酶切位點(diǎn),通過(guò)酶切與連接,將目的基因ldha構(gòu)建到了載體pET28a(+)上,形成了表達(dá)載體 pET28a(+)-ldha(圖3)。

    圖2 ldha基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

    圖3 pET28a(+)-ldha原核表達(dá)載體的構(gòu)建

    將構(gòu)建好的載體pET28a(+)-ldha轉(zhuǎn)化為E.coli BL21(DE3),經(jīng)培養(yǎng)后,提取質(zhì)粒做PCR和雙酶切驗(yàn)證。PCR擴(kuò)增結(jié)果表明,經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)得到大小為999 bp的核苷酸片段(圖4)與理論推測(cè)一致。用EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切后檢測(cè)得到2條大小分別為5 350 bp和989 bp的核苷酸片段(圖5),表明ldha基因片段已連接到質(zhì)粒pET28a(+)上。將陽(yáng)性克隆子送至生物公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與ldha原序列用軟件DNAMAN比對(duì)兩者的同源性,結(jié)果顯示同源性為100%,說(shuō)明ldha基因已成功插入pET28a(+)載體中,進(jìn)一步證明了表達(dá)載體pET28a(+)-ldha構(gòu)建成功,可供后續(xù)蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)使用。

    圖4 重組質(zhì)粒pET28a(+)-ldha的PCR驗(yàn)證

    圖5 質(zhì)粒pET28a(+)-ldha酶切驗(yàn)證

    2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

    分別挑取經(jīng)驗(yàn)證正確的陽(yáng)性克隆子E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-ldha與空載體對(duì)照菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。培養(yǎng)菌株 OD600達(dá)0.6~0.8時(shí)將其用1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)8 h,離心收集菌體,進(jìn)行SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在分子量為36 kDa處有一明顯的蛋白質(zhì)表達(dá)條帶(圖6),蛋白大小與理論推測(cè)值一致,而對(duì)照空載菌株則幾乎沒(méi)有該蛋白表達(dá)條帶,說(shuō)明該蛋白條帶為L(zhǎng)DH-A蛋白表達(dá)條帶。

    圖6 E.coli BL21(DE3)/pET28A(+)-ldha表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析

    3 討論

    乳酸脫氫酶是以NAD為輔酶,催化生物體內(nèi)糖代謝過(guò)程中乳酸與丙酮酸之間可逆反應(yīng)的一組同工酶。作為糖酵解途徑中一種重要的酶,它廣泛存在于生物體內(nèi),并具有組織器官特異性。乳酸脫氫酶在人體中主要分布于腎、心肌、肝、脾、紅細(xì)胞和白細(xì)胞等組織或器官中[6]。而腫瘤細(xì)胞具有一種獨(dú)特的代謝途徑,它的糖酵解進(jìn)行的順序與三羧酸循環(huán)缺少聯(lián)系,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞利用葡萄糖的量會(huì)比正常組織細(xì)胞高5~10倍,其中多數(shù)轉(zhuǎn)變成了乳酸鹽。許多腫瘤相關(guān)研究表明,患者的發(fā)作期,無(wú)論初發(fā)或復(fù)發(fā),其血清LDH水平均較正常明顯增高,患者癌細(xì)胞中的LDH顯著高于正常組織[7-8],可作為代表全身腫瘤細(xì)胞負(fù)荷的一項(xiàng)重要指標(biāo)。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能與上述腫瘤細(xì)胞的代謝特性有關(guān)。但是,目前對(duì)于癌基因和糖酵解的關(guān)聯(lián)還了解甚少,已證明了ldha是c-Myc致癌轉(zhuǎn)錄因子的直接靶基因[9-10]。此外,腫瘤細(xì)胞中低氧癥可誘導(dǎo)因子(HIF-1)能調(diào)控LDH-A[11-12],如敲除或減少 LDH-A 可明顯抑制腫瘤細(xì)胞對(duì)缺氧的耐受力。接種了敲除或降低LDH-A表達(dá)的患癌小鼠,生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)[13]。減少ldha能抑制腫瘤初期的形成及腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移,這是因?yàn)樵谡=M織細(xì)胞中既不會(huì)含氧低也沒(méi)有活化的c-Myc,而在腫瘤細(xì)胞中含氧量低[10]。ldha基因表達(dá)的減少會(huì)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和腫瘤細(xì)胞死亡。

    在本實(shí)驗(yàn)中,將ldha基因構(gòu)建到表達(dá)載體pET28a(+)中,得到重組表達(dá)載體pET28a(+)-ldha,轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3),獲得了重組菌株。在IPTG誘導(dǎo)下,ldha基因在大腸桿菌中得到了成功表達(dá),這為今后LDH-A蛋白的快速檢測(cè),闡明ldha基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展及其他重大疾病中的關(guān)鍵作用提供了參考。

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