• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    乳酸脫氫酶A(ldha)基因的克隆與原核表達(dá)

    2012-06-02 09:32:54許香雅沈榕強(qiáng)
    關(guān)鍵詞:乳酸克隆質(zhì)粒

    袁 軍,許香雅,沈榕強(qiáng)

    (福建農(nóng)林大學(xué) a.生命科學(xué)學(xué)院;b.生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福州 350002)

    乳酸脫氫酶(lactate dehydmgenaLse,LDH)是糖代謝中的主要酶類,可催化生物體內(nèi)丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸,也是腫瘤發(fā)生、發(fā)展中Warburg效應(yīng)的重要效應(yīng)酶。Warburg效應(yīng)是指腫瘤在發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中,能量獲得方式由有氧方式轉(zhuǎn)化為無(wú)氧糖酵解方式的現(xiàn)象。在脊椎動(dòng)物體內(nèi),LDH存在3種亞基[1],分別為A(或稱M亞基)、B(或稱H亞基)、C。研究表明,減少ldha基因的表達(dá)能減少細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和顯著地延長(zhǎng)腫瘤的形成時(shí)間,因此,ldha基因在腫瘤的形成初期和腫瘤的發(fā)生過(guò)程中扮演著重要角色[2-3]。ldha基因編碼的LHD-A蛋白是腫瘤相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)控因子HIF-1α及c-Myc的效應(yīng)蛋白,它在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用,由于基因改變和腫瘤低氧癥,許多癌細(xì)胞消耗大量的葡萄糖并且通過(guò)LDH-A生成乳酸。LDH-A表達(dá)水平的變化直接關(guān)聯(lián)著腫瘤的發(fā)展程度[4]。此外,在人體內(nèi)LDH-A同工酶譜的變化也可從一定程度上反映組織器官的病變,對(duì)診斷心腦血管疾病、呼吸道疾病、肝臟疾病、腫瘤等均有重要參考價(jià)值。為了得到LDH-A的純蛋白,以便在腫瘤相關(guān)通路中進(jìn)行LDH-A蛋白水平的檢測(cè),并進(jìn)一步闡明ldha基因作用的分子機(jī)理,本文對(duì)Hela細(xì)胞中的LDH-A蛋白編碼基因進(jìn)行了克隆,并在E.coli中進(jìn)行表達(dá)研究。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株和質(zhì)粒

    本實(shí)驗(yàn)所涉及的菌株見(jiàn)表1,質(zhì)粒見(jiàn)表2。

    表1 本實(shí)驗(yàn)所用到的菌株

    表2 本實(shí)驗(yàn)所用到的質(zhì)粒

    1.1.2 主要試劑

    限制性內(nèi)切酶EcoR I和 HindⅢ、Taq酶、T4-DNA連接酶、卡那霉素(Kan)均購(gòu)自Takara公司。質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物基因科技公司。RNA提取試劑TRIzol Reagent購(gòu)自lnvitrogen公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒均購(gòu)自Tiangen公司。IPTG(異丙基硫代-β-D半乳糖苷)購(gòu)自Sigma公司。丙烯酰胺和N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺為Bio-Rad公司產(chǎn)品。寡核苷酸引物由上海鼎安生物科技有限公司合成。

    1.2 表達(dá)載體pET28a(+)-ldha的構(gòu)建

    參照TRIzol(Invitrogen)說(shuō)明書(shū)的方法提取Hela細(xì)胞中的總RNA。反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA過(guò)程按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。從Genebank獲得ldha基因的全核苷酸序列,使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增ldha基因編碼序列所需的引物,F(xiàn):5’-下劃線部分分別為 EcoR I和HindⅢ的酶切位點(diǎn)。PCR反應(yīng)體系(25 μL)如下:10×EX Taq PCR Buffer 2.5 μL,dNTP(2.5 mmol·L-1)1 μL,引物(20 μmol·L-1)各 0.3 μL,模板 1 μL,EX Taq 酶(2.5 U·μL-1)0.2 μL。PCR 反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min;94℃變性45 s,59℃退火45 s,72℃延伸1.5 min,循環(huán)32次后72℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及質(zhì)粒pET28a(+)經(jīng)純化后,用EcoR I和HindⅢ進(jìn)行雙酶切,然后用T4-DNA連接酶于16℃進(jìn)行連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)。涂布于LB+Kan平板上,37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h,挑取單菌落接種于4 mL LB+Kan培養(yǎng)基中,于 37℃ 180 r·min-1搖床培養(yǎng)16h。挑取陽(yáng)性克隆做PCR及酶切驗(yàn)證。將經(jīng)驗(yàn)證的陽(yáng)性克隆子送公司測(cè)序后與ldha基因原序列進(jìn)行同源性比對(duì)。序列正確的質(zhì)粒即為獲得的表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-ldha。實(shí)驗(yàn)具體操作方法參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》[5]。

    1.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

    挑取經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證的E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-ldha和 E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)單菌落,分別接種于4 mL含卡那霉素(10 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中,37℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。按1%接種量分別將菌體轉(zhuǎn)接于含相應(yīng)抗生素的50 mL LB液體培養(yǎng)基中,37℃恒溫振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6 ~0.8,加 IPTG 至終濃度 1.0 mmol/L,28℃繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)8 h。然后4℃離心1 min(12 000 r·min-1),棄上清留菌體沉淀,再用 80 μL 5×SDS-PAGE樣品緩沖液重懸,放入100℃沸水煮3 ~5 min 后取出,離心5 min(12 000 r·min-1),上清液用于SDS-PAGE分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 ldha基因的克隆

    參照TRIzol說(shuō)明書(shū)的方法獲得了Hela細(xì)胞的總RNA,提取結(jié)果如圖1所示。以RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板,與合成的引物擴(kuò)增得到ldha目的基因片段,大小為999 bp(圖2),與預(yù)期大小相符。

    圖1 Hela細(xì)胞中抽提的總RNA

    2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建與驗(yàn)證

    PCR產(chǎn)物與載體pET28a(+)具有相同酶切位點(diǎn),通過(guò)酶切與連接,將目的基因ldha構(gòu)建到了載體pET28a(+)上,形成了表達(dá)載體 pET28a(+)-ldha(圖3)。

    圖2 ldha基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

    圖3 pET28a(+)-ldha原核表達(dá)載體的構(gòu)建

    將構(gòu)建好的載體pET28a(+)-ldha轉(zhuǎn)化為E.coli BL21(DE3),經(jīng)培養(yǎng)后,提取質(zhì)粒做PCR和雙酶切驗(yàn)證。PCR擴(kuò)增結(jié)果表明,經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)得到大小為999 bp的核苷酸片段(圖4)與理論推測(cè)一致。用EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切后檢測(cè)得到2條大小分別為5 350 bp和989 bp的核苷酸片段(圖5),表明ldha基因片段已連接到質(zhì)粒pET28a(+)上。將陽(yáng)性克隆子送至生物公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與ldha原序列用軟件DNAMAN比對(duì)兩者的同源性,結(jié)果顯示同源性為100%,說(shuō)明ldha基因已成功插入pET28a(+)載體中,進(jìn)一步證明了表達(dá)載體pET28a(+)-ldha構(gòu)建成功,可供后續(xù)蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)使用。

    圖4 重組質(zhì)粒pET28a(+)-ldha的PCR驗(yàn)證

    圖5 質(zhì)粒pET28a(+)-ldha酶切驗(yàn)證

    2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

    分別挑取經(jīng)驗(yàn)證正確的陽(yáng)性克隆子E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-ldha與空載體對(duì)照菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。培養(yǎng)菌株 OD600達(dá)0.6~0.8時(shí)將其用1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)8 h,離心收集菌體,進(jìn)行SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在分子量為36 kDa處有一明顯的蛋白質(zhì)表達(dá)條帶(圖6),蛋白大小與理論推測(cè)值一致,而對(duì)照空載菌株則幾乎沒(méi)有該蛋白表達(dá)條帶,說(shuō)明該蛋白條帶為L(zhǎng)DH-A蛋白表達(dá)條帶。

    圖6 E.coli BL21(DE3)/pET28A(+)-ldha表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析

    3 討論

    乳酸脫氫酶是以NAD為輔酶,催化生物體內(nèi)糖代謝過(guò)程中乳酸與丙酮酸之間可逆反應(yīng)的一組同工酶。作為糖酵解途徑中一種重要的酶,它廣泛存在于生物體內(nèi),并具有組織器官特異性。乳酸脫氫酶在人體中主要分布于腎、心肌、肝、脾、紅細(xì)胞和白細(xì)胞等組織或器官中[6]。而腫瘤細(xì)胞具有一種獨(dú)特的代謝途徑,它的糖酵解進(jìn)行的順序與三羧酸循環(huán)缺少聯(lián)系,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞利用葡萄糖的量會(huì)比正常組織細(xì)胞高5~10倍,其中多數(shù)轉(zhuǎn)變成了乳酸鹽。許多腫瘤相關(guān)研究表明,患者的發(fā)作期,無(wú)論初發(fā)或復(fù)發(fā),其血清LDH水平均較正常明顯增高,患者癌細(xì)胞中的LDH顯著高于正常組織[7-8],可作為代表全身腫瘤細(xì)胞負(fù)荷的一項(xiàng)重要指標(biāo)。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能與上述腫瘤細(xì)胞的代謝特性有關(guān)。但是,目前對(duì)于癌基因和糖酵解的關(guān)聯(lián)還了解甚少,已證明了ldha是c-Myc致癌轉(zhuǎn)錄因子的直接靶基因[9-10]。此外,腫瘤細(xì)胞中低氧癥可誘導(dǎo)因子(HIF-1)能調(diào)控LDH-A[11-12],如敲除或減少 LDH-A 可明顯抑制腫瘤細(xì)胞對(duì)缺氧的耐受力。接種了敲除或降低LDH-A表達(dá)的患癌小鼠,生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)[13]。減少ldha能抑制腫瘤初期的形成及腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移,這是因?yàn)樵谡=M織細(xì)胞中既不會(huì)含氧低也沒(méi)有活化的c-Myc,而在腫瘤細(xì)胞中含氧量低[10]。ldha基因表達(dá)的減少會(huì)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和腫瘤細(xì)胞死亡。

    在本實(shí)驗(yàn)中,將ldha基因構(gòu)建到表達(dá)載體pET28a(+)中,得到重組表達(dá)載體pET28a(+)-ldha,轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3),獲得了重組菌株。在IPTG誘導(dǎo)下,ldha基因在大腸桿菌中得到了成功表達(dá),這為今后LDH-A蛋白的快速檢測(cè),闡明ldha基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展及其他重大疾病中的關(guān)鍵作用提供了參考。

    [1]袁勤生.現(xiàn)代酶學(xué)[M].上海:華東理工大學(xué)出版社,2001:23-25.

    [2]Fantin V R,St-Pierre J,Leder P.Attenuation of LDH-A expression uncovers a link between glycolysis,mitochondrial physiology,and tumor maintenance[J].Cancer Cell,2006,9:425 -434.

    [3]Xie H,Valera V A,Merino M J,et al.LDH - A inhibition,a therapeutic strategy for treatment of hereditary leiomyomatosis and renal cell cancer[J].Mol Cancer Ther 2009,8:626-635.

    [4]張碧蓮.乳酸脫氫酶對(duì)惡性腫瘤的診斷意義[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2010,31(10):1172 -1173.

    [5]薩姆布魯克·拉塞爾.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(上、下冊(cè))[M].3版.黃培堂,譯.北京:科學(xué)出版社,2002:1228-1232.

    [6]周新,徐植光.臨床生物化學(xué)和生物化學(xué)檢驗(yàn)[M].3版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2004:169-452.

    [7]曹莉萍,呂嬌風(fēng),牟秀萍,等.血清GGT、ALP和LDH聯(lián)檢測(cè)定對(duì)癌癥患者的診斷及意義[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2008,26(4):437 -438.

    [8]施瑞浩,張新,白春學(xué).血清乳酸脫氫酶與原發(fā)性肺癌分期的關(guān)系[J].中國(guó)臨床醫(yī)學(xué),2008,15(2):172-173.

    [9]Lewis B C,Shim H,Li Q,et al.Identification of putative c-Myc-responsive genes:Characterization of rcl,a novel growth-related gene[J].Mol Cell Biol,1997,17:4967-4978.

    [10]Shim H,Dolde C,Lewis B C,et al.c-Myc transactivation of LDH-A:Implications for tumor metabolism and growth[J].Proc Natl Acad Sci USA,1997,94:6658 -6663.

    [11]Semenza G L,Jiang B H,Leung S W,et al.Hypoxia response elements in the aldolase A,enolase 1,and lactate dehydrogenase A gene promoters contain essential binding sites for hypoxiainduciblefactor[J].Biol Chem,1996,271:32529-32537.

    [12]Firth J D,Ebert B L,Ratcliffe P J.Hypoxic regulation of lactate dehydrogenase A.Interaction between hypoxia-inducible factor 1 and cAMP response elements[J].Biol Chem,1995,270:21021 -21027.

    [13]Fantin V R,St-Pierre J and Leder P.Attenuation of LDHA expression uncovers a link between glycolysis,mitochondrial physiology,and tumor maintenance[J].Cancer Cell,2006,9(6):425 -434.

    猜你喜歡
    乳酸克隆質(zhì)粒
    克隆狼
    老年心力衰竭患者BNP及乳酸水平與心功能的相關(guān)性
    二甲雙胍與乳酸酸中毒及其在冠狀動(dòng)脈造影期間的應(yīng)用
    浙江:誕生首批體細(xì)胞克隆豬
    短乳桿菌天然質(zhì)粒分類
    腹腔鏡手術(shù)相關(guān)的高乳酸血癥或乳酸性酸中毒
    抗BP5-KLH多克隆抗體的制備及鑒定
    重組質(zhì)粒rAd-EGF構(gòu)建并轉(zhuǎn)染hDPSCs對(duì)其增殖的影響
    產(chǎn)乳酸鏈球菌素的乳酸乳球菌的等離子體誘變選育
    Survivin-siRNA重組質(zhì)粒對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y的作用
    无限看片的www在线观看| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 少妇被粗大的猛进出69影院| 男女之事视频高清在线观看| 成人黄色视频免费在线看| 亚洲综合色网址| 中文字幕av电影在线播放| 国产精品1区2区在线观看. | 窝窝影院91人妻| 亚洲精品第二区| 搡老岳熟女国产| 亚洲久久久国产精品| 精品福利永久在线观看| 午夜久久久在线观看| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 老司机靠b影院| 另类亚洲欧美激情| 麻豆av在线久日| 在线av久久热| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 午夜免费成人在线视频| www.999成人在线观看| a级毛片在线看网站| 亚洲成国产人片在线观看| 真人做人爱边吃奶动态| 18禁观看日本| 在线天堂中文资源库| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| av天堂久久9| 岛国在线观看网站| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 最近中文字幕2019免费版| 在线观看免费午夜福利视频| 91精品伊人久久大香线蕉| 999久久久精品免费观看国产| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 成年美女黄网站色视频大全免费| 中文字幕色久视频| 亚洲成人手机| 国产精品久久久久成人av| 丰满迷人的少妇在线观看| 成年人免费黄色播放视频| 宅男免费午夜| 叶爱在线成人免费视频播放| 亚洲成国产人片在线观看| 国产免费一区二区三区四区乱码| 亚洲少妇的诱惑av| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 丁香六月欧美| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 色94色欧美一区二区| 欧美日韩福利视频一区二区| 精品国内亚洲2022精品成人 | 91麻豆av在线| 老熟妇乱子伦视频在线观看 | 三级毛片av免费| 久久久久久久久免费视频了| 三上悠亚av全集在线观看| 亚洲久久久国产精品| 国产精品偷伦视频观看了| 91大片在线观看| 又紧又爽又黄一区二区| 日韩电影二区| 国产福利在线免费观看视频| 久久久精品94久久精品| 久久人人爽人人片av| 两个人免费观看高清视频| 69av精品久久久久久 | 老司机亚洲免费影院| 丁香六月天网| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 啦啦啦啦在线视频资源| 十八禁网站免费在线| 两性夫妻黄色片| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 少妇 在线观看| 成年动漫av网址| 欧美激情极品国产一区二区三区| 视频在线观看一区二区三区| 中文字幕最新亚洲高清| 国产一级毛片在线| 一区福利在线观看| 国产三级黄色录像| 69精品国产乱码久久久| 91麻豆av在线| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 人妻 亚洲 视频| 老鸭窝网址在线观看| 亚洲avbb在线观看| 妹子高潮喷水视频| 亚洲中文av在线| 精品国产乱码久久久久久小说| 搡老乐熟女国产| 亚洲五月色婷婷综合| 在线永久观看黄色视频| 成人手机av| 黄片播放在线免费| 99久久人妻综合| 90打野战视频偷拍视频| 各种免费的搞黄视频| 搡老熟女国产l中国老女人| 丝瓜视频免费看黄片| www.av在线官网国产| av福利片在线| 亚洲中文日韩欧美视频| 亚洲 国产 在线| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 视频区图区小说| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 91成年电影在线观看| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 人妻人人澡人人爽人人| 日本欧美视频一区| 最近最新免费中文字幕在线| 黑人欧美特级aaaaaa片| 男人舔女人的私密视频| 久久精品人人爽人人爽视色| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 在线观看人妻少妇| av网站免费在线观看视频| 大片电影免费在线观看免费| 97精品久久久久久久久久精品| 少妇被粗大的猛进出69影院| 超色免费av| 丰满迷人的少妇在线观看| 在线观看www视频免费| 国产91精品成人一区二区三区 | 9色porny在线观看| 国产精品一二三区在线看| 国产伦理片在线播放av一区| av福利片在线| 又黄又粗又硬又大视频| 久久久精品免费免费高清| 日韩人妻精品一区2区三区| 欧美国产精品一级二级三级| 老汉色∧v一级毛片| 日本黄色日本黄色录像| 国产区一区二久久| 国产精品熟女久久久久浪| 啦啦啦免费观看视频1| 男女免费视频国产| 伦理电影免费视频| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲性夜色夜夜综合| 成人国语在线视频| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 亚洲国产欧美在线一区| 亚洲精品成人av观看孕妇| 欧美激情 高清一区二区三区| 国产精品偷伦视频观看了| 脱女人内裤的视频| 丝瓜视频免费看黄片| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 一级毛片电影观看| 欧美 日韩 精品 国产| 国产一区二区激情短视频 | avwww免费| 国产精品 国内视频| 91大片在线观看| 12—13女人毛片做爰片一| 国产精品.久久久| 少妇人妻久久综合中文| 无限看片的www在线观看| 青春草视频在线免费观看| 一级,二级,三级黄色视频| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 另类精品久久| 99国产综合亚洲精品| 少妇的丰满在线观看| a级毛片黄视频| 国产精品久久久人人做人人爽| 亚洲人成电影观看| 久久 成人 亚洲| 新久久久久国产一级毛片| 最近最新中文字幕大全免费视频| 精品第一国产精品| 丁香六月天网| av超薄肉色丝袜交足视频| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 欧美 日韩 精品 国产| 99精国产麻豆久久婷婷| 精品一区在线观看国产| www.自偷自拍.com| 欧美xxⅹ黑人| 黄色a级毛片大全视频| 三上悠亚av全集在线观看| 成在线人永久免费视频| 男女国产视频网站| 老熟女久久久| 美女大奶头黄色视频| 中国国产av一级| 亚洲精品国产av蜜桃| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 欧美另类亚洲清纯唯美| 激情视频va一区二区三区| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 国产精品99久久99久久久不卡| 亚洲第一青青草原| 日本vs欧美在线观看视频| 免费日韩欧美在线观看| 十八禁网站免费在线| av片东京热男人的天堂| 国产精品国产三级国产专区5o| 日本黄色日本黄色录像| 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 国产亚洲av高清不卡| 国产在线免费精品| 法律面前人人平等表现在哪些方面 | 一二三四社区在线视频社区8| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 一本大道久久a久久精品| 另类亚洲欧美激情| 一区二区日韩欧美中文字幕| 亚洲精品乱久久久久久| 午夜精品国产一区二区电影| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 国产1区2区3区精品| 久久狼人影院| 国产麻豆69| 97精品久久久久久久久久精品| 色94色欧美一区二区| 久久久精品94久久精品| 一个人免费看片子| 一进一出抽搐动态| 麻豆乱淫一区二区| 久久精品国产亚洲av高清一级| 高潮久久久久久久久久久不卡| 欧美av亚洲av综合av国产av| 国产国语露脸激情在线看| www日本在线高清视频| 日本精品一区二区三区蜜桃| 美女扒开内裤让男人捅视频| 精品亚洲成国产av| av福利片在线| 丰满饥渴人妻一区二区三| 国产精品av久久久久免费| 成人影院久久| 91成人精品电影| 久久性视频一级片| 丝袜脚勾引网站| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 亚洲精品国产一区二区精华液| 久久国产精品影院| 满18在线观看网站| 我要看黄色一级片免费的| 国产欧美亚洲国产| 色视频在线一区二区三区| 日韩精品免费视频一区二区三区| 十分钟在线观看高清视频www| 在线观看www视频免费| 高清黄色对白视频在线免费看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| kizo精华| 首页视频小说图片口味搜索| 十八禁高潮呻吟视频| 在线观看免费日韩欧美大片| 国产精品99久久99久久久不卡| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 色视频在线一区二区三区| 男女无遮挡免费网站观看| 亚洲伊人久久精品综合| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 91国产中文字幕| 老司机影院成人| 性高湖久久久久久久久免费观看| av在线播放精品| 1024香蕉在线观看| 男女国产视频网站| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 欧美日韩福利视频一区二区| 丝袜在线中文字幕| 国产色视频综合| av免费在线观看网站| 国产精品av久久久久免费| 窝窝影院91人妻| 久久中文看片网| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲全国av大片| 久久九九热精品免费| 国产精品99久久99久久久不卡| 日韩欧美免费精品| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 人妻一区二区av| 成人三级做爰电影| videos熟女内射| 久久久国产成人免费| 女性被躁到高潮视频| 最近中文字幕2019免费版| 看免费av毛片| 在线永久观看黄色视频| 丁香六月欧美| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 一区二区av电影网| 九色亚洲精品在线播放| 天堂中文最新版在线下载| 欧美少妇被猛烈插入视频| 丰满少妇做爰视频| 女人久久www免费人成看片| 最新在线观看一区二区三区| 九色亚洲精品在线播放| 国产成人精品无人区| 欧美久久黑人一区二区| 91成人精品电影| 男人操女人黄网站| 欧美激情久久久久久爽电影 | 欧美日韩亚洲高清精品| 免费看十八禁软件| 久久青草综合色| 国产精品1区2区在线观看. | 极品人妻少妇av视频| 精品少妇久久久久久888优播| 欧美精品亚洲一区二区| 午夜福利乱码中文字幕| 精品欧美一区二区三区在线| 亚洲熟女毛片儿| 久久亚洲国产成人精品v| 国产成人啪精品午夜网站| 国产亚洲一区二区精品| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 亚洲国产欧美网| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲人成电影观看| 动漫黄色视频在线观看| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 免费在线观看日本一区| 黄色视频不卡| 亚洲国产中文字幕在线视频| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 69精品国产乱码久久久| 曰老女人黄片| 两个人免费观看高清视频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 国产在线一区二区三区精| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 成年av动漫网址| 亚洲一码二码三码区别大吗| 不卡av一区二区三区| 久久久欧美国产精品| bbb黄色大片| 久久久久久久大尺度免费视频| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲av美国av| 亚洲综合色网址| 12—13女人毛片做爰片一| 国产一区二区三区av在线| 午夜福利影视在线免费观看| 99re6热这里在线精品视频| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产精品影院久久| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 午夜激情av网站| 亚洲中文av在线| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 午夜福利乱码中文字幕| 日韩制服骚丝袜av| 狂野欧美激情性bbbbbb| 一级,二级,三级黄色视频| 精品国产国语对白av| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 欧美成狂野欧美在线观看| 久久精品国产综合久久久| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 一级片'在线观看视频| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 啦啦啦 在线观看视频| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 国产高清视频在线播放一区 | 精品一区二区三区av网在线观看 | 国产主播在线观看一区二区| 一进一出抽搐动态| 激情视频va一区二区三区| 这个男人来自地球电影免费观看| 午夜91福利影院| 蜜桃在线观看..| 成人影院久久| 少妇精品久久久久久久| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 亚洲一区二区三区欧美精品| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 久久精品人人爽人人爽视色| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 午夜免费成人在线视频| 欧美黄色淫秽网站| 久久久久久人人人人人| 超色免费av| 不卡一级毛片| av超薄肉色丝袜交足视频| 久久国产亚洲av麻豆专区| 91成年电影在线观看| 国产高清videossex| 新久久久久国产一级毛片| 亚洲精品乱久久久久久| 嫩草影视91久久| 视频在线观看一区二区三区| 久久久精品区二区三区| 欧美精品一区二区大全| 国产高清国产精品国产三级| 99精品欧美一区二区三区四区| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产在线观看jvid| 中文字幕人妻熟女乱码| 日韩一区二区三区影片| 精品熟女少妇八av免费久了| 日韩中文字幕欧美一区二区| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 久久久久网色| 99精国产麻豆久久婷婷| xxxhd国产人妻xxx| 国产免费现黄频在线看| 制服人妻中文乱码| 一区福利在线观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 午夜影院在线不卡| 丝袜人妻中文字幕| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产成人影院久久av| 久久久久久免费高清国产稀缺| 母亲3免费完整高清在线观看| 热re99久久国产66热| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 脱女人内裤的视频| 日本91视频免费播放| 高清av免费在线| 好男人电影高清在线观看| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 中国美女看黄片| 亚洲精品第二区| 天堂中文最新版在线下载| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 中国国产av一级| 少妇精品久久久久久久| 国产精品免费大片| av在线老鸭窝| 在线观看免费午夜福利视频| 国产一区有黄有色的免费视频| 精品国产一区二区久久| 亚洲精品成人av观看孕妇| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲国产av新网站| 12—13女人毛片做爰片一| 少妇人妻久久综合中文| 国产精品久久久久久精品古装| 国产精品 国内视频| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 人妻人人澡人人爽人人| 五月开心婷婷网| 搡老熟女国产l中国老女人| 成年人免费黄色播放视频| 777米奇影视久久| 蜜桃在线观看..| 亚洲欧洲日产国产| 十八禁网站网址无遮挡| www.熟女人妻精品国产| 亚洲 国产 在线| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 丰满饥渴人妻一区二区三| 精品福利永久在线观看| 亚洲成人免费电影在线观看| 99国产精品一区二区蜜桃av | 永久免费av网站大全| 精品国内亚洲2022精品成人 | 狂野欧美激情性xxxx| 热re99久久精品国产66热6| 男女下面插进去视频免费观看| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 人成视频在线观看免费观看| 韩国高清视频一区二区三区| 日韩人妻精品一区2区三区| 窝窝影院91人妻| 免费观看av网站的网址| 高清欧美精品videossex| 国产精品 国内视频| 欧美国产精品va在线观看不卡| 老司机影院毛片| 欧美日韩av久久| 久久人妻熟女aⅴ| 一级毛片女人18水好多| 中文字幕人妻丝袜制服| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲精品自拍成人| 曰老女人黄片| 男女免费视频国产| 欧美亚洲日本最大视频资源| 后天国语完整版免费观看| 精品亚洲成国产av| 色婷婷av一区二区三区视频| 热99久久久久精品小说推荐| 欧美国产精品一级二级三级| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 精品一区二区三区av网在线观看 | 少妇人妻久久综合中文| 99国产精品一区二区三区| 午夜福利在线免费观看网站| 午夜免费鲁丝| 精品国产乱码久久久久久男人| 99久久综合免费| 精品少妇黑人巨大在线播放| 不卡av一区二区三区| 国产亚洲精品久久久久5区| 国产精品国产三级国产专区5o| 久久免费观看电影| av电影中文网址| 十八禁人妻一区二区| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 女警被强在线播放| 老司机靠b影院| 国产亚洲精品第一综合不卡| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 亚洲精品第二区| 亚洲国产av新网站| 亚洲专区中文字幕在线| 香蕉国产在线看| 国产精品久久久久久精品古装| 国产av精品麻豆| 国产精品1区2区在线观看. | 日本精品一区二区三区蜜桃| 咕卡用的链子| 99国产综合亚洲精品| 真人做人爱边吃奶动态| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲国产精品成人久久小说| 大型av网站在线播放| 亚洲精品国产av成人精品| 欧美日韩成人在线一区二区| 另类精品久久| 91麻豆av在线| 久久狼人影院| 91精品国产国语对白视频| 美女高潮到喷水免费观看| 成年人午夜在线观看视频| 性色av乱码一区二区三区2| 黑人操中国人逼视频| 一级,二级,三级黄色视频| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 欧美一级毛片孕妇| 亚洲少妇的诱惑av| 国产黄色免费在线视频| 97在线人人人人妻| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲男人天堂网一区| 久久ye,这里只有精品| 99国产综合亚洲精品| 我要看黄色一级片免费的| 国产黄频视频在线观看| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 久久性视频一级片| 国产高清视频在线播放一区 | 国产成人系列免费观看| 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 看免费av毛片| 黄色视频不卡| 一二三四在线观看免费中文在| 麻豆av在线久日| 涩涩av久久男人的天堂| 国产男人的电影天堂91| 午夜影院在线不卡| 国产精品免费大片| 精品人妻在线不人妻| 欧美大码av| 国产av一区二区精品久久| 天堂8中文在线网| 久久久久精品人妻al黑| 水蜜桃什么品种好| 久久久久国内视频| av在线老鸭窝| 老司机福利观看| 久久久国产精品麻豆| 亚洲专区字幕在线| 成年人黄色毛片网站| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 在线av久久热| 考比视频在线观看| 黑人猛操日本美女一级片| 国产精品av久久久久免费| 中文字幕精品免费在线观看视频| 久久香蕉激情| 亚洲少妇的诱惑av| 日本av手机在线免费观看| 久久久久精品人妻al黑| 一级毛片女人18水好多| 一个人免费在线观看的高清视频 | 曰老女人黄片| 99久久国产精品久久久| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 久久 成人 亚洲| 久久中文字幕一级| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 免费不卡黄色视频| 精品少妇黑人巨大在线播放| 久久99热这里只频精品6学生| 久久免费观看电影| 韩国高清视频一区二区三区| 2018国产大陆天天弄谢| 另类亚洲欧美激情| av不卡在线播放| 亚洲精品自拍成人| 在线观看一区二区三区激情| 男女高潮啪啪啪动态图| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 中文字幕精品免费在线观看视频| 操出白浆在线播放| 久久久国产欧美日韩av|