反應(yīng)曲線在速率法檢測(cè)AST底物耗盡現(xiàn)象中的應(yīng)用

任崢 鄒翠美 夏春燕

酶活性檢測(cè)是臨床生化常規(guī)一個(gè)重要組成部分，全自動(dòng)生化分析儀由于其高精密度和光柵的應(yīng)用，為用速率法準(zhǔn)確檢測(cè)各種酶的活性提供了很好的保證。當(dāng)標(biāo)本中酶含量過(guò)高，此時(shí)就容易出現(xiàn)在檢測(cè)過(guò)程中酶的底物短時(shí)間內(nèi)消耗殆盡，即從開(kāi)始讀點(diǎn)之前至反應(yīng)終點(diǎn)的吸光度反應(yīng)曲線的一段或整段為一平坦曲線，使得反應(yīng)吸光度變化近乎為零，其斜率不符合實(shí)際情況，所得反應(yīng)結(jié)果也與真實(shí)值不符，這種現(xiàn)象稱為底物耗盡［1］。此種情況下，檢驗(yàn)者若只從檢驗(yàn)結(jié)果分析往往會(huì)發(fā)出錯(cuò)誤的報(bào)告，從而影響臨床診斷和治療。本文通過(guò)對(duì)16例AST高值標(biāo)本進(jìn)行原倍和稀釋5倍、10倍進(jìn)行測(cè)定，再通過(guò)對(duì)反應(yīng)曲線的觀察分析，發(fā)現(xiàn)和解決底物耗盡現(xiàn)象問(wèn)題。

資料與方法

1.檢測(cè)對(duì)象:16例AST高值標(biāo)本。

2.檢測(cè)方法:將16例AST高值標(biāo)本分為對(duì)照組和問(wèn)題組，分別檢測(cè)其原倍及去離子水稀釋5倍、10倍標(biāo)本的AST值，結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)。所有標(biāo)本均測(cè)三次，取平均值。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:將對(duì)照組及問(wèn)題組各高值標(biāo)本5倍稀釋結(jié)果與未稀釋結(jié)果，10倍稀釋結(jié)果分別與未稀釋結(jié)果和5倍稀釋結(jié)果進(jìn)行多樣本比較的秩和檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

對(duì)照組及問(wèn)題組原倍和去離子水稀釋5倍及10倍檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1，對(duì)照組1－8號(hào)標(biāo)本原倍分別與5倍、10倍稀釋結(jié)果比較，5倍稀釋與10倍稀釋結(jié)果比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);問(wèn)題組1－8號(hào)標(biāo)本原倍分別與5倍、10倍稀釋結(jié)果進(jìn)行比較，5倍稀釋與10倍稀釋結(jié)果比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，問(wèn)題組樣本兩兩比較結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 AST高值標(biāo)本原倍及稀釋檢測(cè)結(jié)果(kruskal－wallis H檢驗(yàn))(單位U/L)

表2 問(wèn)題組樣本兩兩比較秩和檢驗(yàn)(Nemenyi檢驗(yàn))結(jié)果

討 論

在酶促反應(yīng)過(guò)程中，不是任何時(shí)期的反應(yīng)速率都和酶濃度成正比。當(dāng)酶促反應(yīng)剛一開(kāi)始，底物處于過(guò)量狀態(tài)，酶與底物開(kāi)始結(jié)合，生成復(fù)合物(ES)，底物濃度開(kāi)始下降，此時(shí)產(chǎn)物尚未形成。當(dāng)復(fù)合物(ES)分解生成產(chǎn)物(P)，酶促反應(yīng)速度急聚上升，經(jīng)過(guò)很短的作用時(shí)間后，產(chǎn)物的生成量或底物的減少量與反應(yīng)時(shí)間成線性關(guān)系，反應(yīng)速度保持恒定不變，這一時(shí)期稱為零級(jí)反應(yīng)期。由于只有在零級(jí)反應(yīng)期，單位時(shí)間內(nèi)吸光度的變化值才與酶的活性成正比，當(dāng)樣本中AST的活性超過(guò)檢測(cè)線性范圍時(shí)，底物在短時(shí)間內(nèi)被耗盡，零級(jí)反應(yīng)期很短，速率法檢測(cè)所設(shè)定的吸光度讀點(diǎn)完全不在零級(jí)反應(yīng)期，以致零級(jí)反應(yīng)期內(nèi)檢測(cè)不到吸光度的變化而出現(xiàn)低值甚至負(fù)值結(jié)果。

通過(guò)觀察1－16號(hào)標(biāo)本反應(yīng)曲線發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組1－8號(hào)標(biāo)本不存在底物耗盡現(xiàn)象，其反應(yīng)曲線在加入試劑2后，所有反應(yīng)曲線為一下降直線，說(shuō)明這一期間反應(yīng)速度保持恒定，吸光度變化值與酶濃度成正比，即△A/點(diǎn)(吸光度變化率)是一定值。問(wèn)題組1－8號(hào)標(biāo)本存在底物耗盡現(xiàn)象，其反應(yīng)曲線在加入試劑2后，其下降曲線都會(huì)出現(xiàn)長(zhǎng)短不一的一段平坦曲線，這是由于在反應(yīng)過(guò)程中酶底物耗盡使得多個(gè)反應(yīng)點(diǎn)吸光度趨于一致，曲線產(chǎn)生一段平臺(tái)期，△A/點(diǎn)≈0，甚至可能是一負(fù)值，則計(jì)算出的結(jié)果不是真實(shí)值。

綜上所述，底物耗盡現(xiàn)象在速率法檢測(cè)酶活性時(shí)都有可能存在，每天通過(guò)觀察其反應(yīng)曲線，可以及時(shí)發(fā)現(xiàn)檢測(cè)中是否存在此現(xiàn)象，如有底物耗盡現(xiàn)象，可通過(guò)稀釋樣本重新檢測(cè)得以解決，這樣可以避免因錯(cuò)誤結(jié)果而延誤對(duì)患者的診斷治療。

1 黃志偉.AST動(dòng)力學(xué)法測(cè)定時(shí)底物耗盡現(xiàn)象淺析［J］.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)儀器與應(yīng)用，2005，17(2):30 －32.