經(jīng)典Wnt信號通路對成骨細胞增殖和分化的影響*

唐 泉 孫元明

骨的重建由骨的生成和吸收構(gòu)成，成骨細胞具有骨的形成功能，破骨細胞具有骨吸收作用。兩者之間的動態(tài)平衡是維持正常骨量的關(guān)鍵。成骨細胞來源于骨髓間充質(zhì)干細胞，在骨形成過程中要經(jīng)歷成骨細胞增殖、細胞外基質(zhì)成熟、細胞外基質(zhì)礦化和成骨細胞凋亡4個階段。其中任何一個階段出現(xiàn)異常時，都會對骨量和骨的組成產(chǎn)生重要的影響。

Wnt蛋白家族為一類高度保守的蛋白家族，其與一系列的生物過程，如胚胎發(fā)育、器官生成及腫瘤形成等有關(guān)[2]。Wnt蛋白在成骨細胞中可以通過經(jīng)典Wnt信號通路調(diào)節(jié)成骨細胞的增殖和分化，參與骨發(fā)生過程的調(diào)節(jié)。經(jīng)典Wnt信號通路的活性降低時，會產(chǎn)生骨組織的畸變[3]。經(jīng)典Wnt通路中各種成分如低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白LRP5、β-catenin等也均分別可以對成骨細胞的發(fā)育過程產(chǎn)生影響，還可能導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥或者骨質(zhì)減少等疾病[4]，現(xiàn)已成為研究成骨細胞代謝的重要靶點[5]。本文對其在成骨細胞的調(diào)節(jié)中所起的作用進行綜述。

1 經(jīng)典Wnt信號通路

Wnt家族由19種高度保守的富含半胱氨酸的分泌型糖蛋白組成[6]，大小為39～46 ku。Wnt通路的命名來源于其家族中前兩個成員：小鼠中的int和果蠅中的wingless。所有的Wnt蛋白含有23～24個半胱氨酸殘基，大部分氨基酸殘基可以形成分子內(nèi)二硫鍵并進行轉(zhuǎn)錄后修飾。Wnt蛋白與由Frizzled（FZD）、G蛋白偶聯(lián)受體（G-protein coupled receptor，GPCR）和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白（low density lipoprotein recep?tor-related protein，LRP）構(gòu)成的膜受體復(fù)合物結(jié)合。這種結(jié)合可以激活兩條信號通路：經(jīng)典Wnt信號通路（Wnt/β-catenin信號通路）和非經(jīng)典Wnt信號通路（Wnt/Ca2+信號通路等）[7]。調(diào)節(jié)骨形成的信號通路主要是LRP5/6的下游信號通路[8]。經(jīng)典Wnt信號通路主要通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄輔助激活因子β-catenin的數(shù)量發(fā)揮作用[9]。

經(jīng)典Wnt信號通路對于成骨細胞的影響首次發(fā)現(xiàn)于其對人類骨質(zhì)疏松癥-假神經(jīng)膠質(zhì)瘤（osteoporosis physiology，OPPG[10]）綜合征和由LRP5基因突變導(dǎo)致的高骨量（high bo?nemass，HBM[10]）表型的研究中。通過LRP5突變的基因敲除和轉(zhuǎn)基因小鼠模型可以弄清楚經(jīng)典Wnt信號通路如何控制骨的形成。

對β-catenin在細胞和亞細胞中位置的調(diào)節(jié)是經(jīng)典信號通路影響細胞功能的核心[11]。當Wnt通路未被激活時，β-catenin水平維持在一個穩(wěn)定的水平。部分β-catenin被多蛋白復(fù)合體磷酸化[12]，該復(fù)合體包括：蛋白激酶1（casein ki?nase 1，CK1）、糖原合酶激酶（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）及支架蛋白等。然后β-catenin被定向泛素化進而通過蛋白酶體機制降解[13]。當Wnt通路被激活后，Wnt蛋白首先與細胞表面受體復(fù)合物（由LRP5和人卷曲蛋白Fzd構(gòu)成，F(xiàn)zd是一種跨膜蛋白）結(jié)合[14]，然后LRP5被GSK-3β雙磷酸化，這一作用將體軸發(fā)育抑制因子Axin募集到膜上，復(fù)合物與Axin結(jié)合，使得細胞表面受體復(fù)合物與CSK-3β分離，該過程的具體機制還不清楚，可能是因為LRP5與Axin的結(jié)合是一種競爭性的對GSK-3β結(jié)合蛋白的活化。CSK-3β可以通過磷酸化β-catenin起到對其抑制的作用。抑制GSK-3β對β-catenin的磷酸化作用是經(jīng)典Wnt信號通路中重要的一步[15]。GSK-3β與其結(jié)合蛋白結(jié)合，失去磷酸化β-catenin的功能。沒有被GSK-3β磷酸化的β-catenin在細胞內(nèi)積累到一定程度后，將對細胞核內(nèi)基因的表達產(chǎn)生一定影響。淋巴細胞增強子結(jié)合因子LEF（lymphoid enhancer binding factor）和T細胞因子TCF（T-cell factor）是β-catenin在細胞核內(nèi)最典型的作用因子。β-catenin替代輔阻遏物（co-repressor，CoR）直接與LEF/TCF結(jié)合并互相作用，并且募集輔助轉(zhuǎn)錄激活因子刺激許多基因的表達，包括原癌基因c-myc和細胞周期蛋白D等。

2 經(jīng)典Wnt信號通路對成骨細胞的影響

經(jīng)典Wnt信號通路對骨髓間充質(zhì)干細胞分化為骨組織的脂肪細胞和軟骨細胞方面的研究已有報道，其對成骨細胞的調(diào)節(jié)也有一定的研究。經(jīng)典Wnt信號通路可以從增殖和分化水平上對成骨細胞進行調(diào)節(jié)。

經(jīng)典Wnt信號通路的激活可以增加成骨細胞的增殖[16]。LRP5基因雙缺失的小鼠體內(nèi)成骨細胞的增殖減少，而LRP5（G171V）的轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)成骨細胞的數(shù)量顯著增加，而且顱骨中凋亡的成骨細胞和軟骨細胞的數(shù)量也減少。Wnt10b基因在間質(zhì)細胞中的過表達在體內(nèi)會使骨密度增加，小梁骨的數(shù)量和厚度也都增加，在體外可以促進成骨細胞的發(fā)生過程[17]。在成年小鼠體內(nèi)，Wnt拮抗物（分泌型卷曲相關(guān)蛋白Sfrp1、異藻藍蛋白Apc、抑癌蛋白Dkk）的表達鈍化或減少可以顯著增加小梁骨的骨量。

Wnt信號通路對成骨細胞分化的各個時期都具有調(diào)節(jié)作用。Wnt蛋白可以刺激成骨細胞分化過程中的一些早期事件并促進前體細胞的生長。在C3H10T1/2、C2C12、ST2細胞系中，一些Wnt蛋白（Wnt3a）可以誘導(dǎo)堿性磷酸酶（ALP）的活性，這是成骨細胞分化早期過程中的重要事件。盡管Wnt3a可以引起ALP活性的顯著改變，但是成骨細胞的其他標記如Runx2、骨鈣素、I型膠原卻不受Wnt分子的影響。在成骨細胞分化階段，Wnt信號通路中的一些關(guān)鍵成分的表達會受到調(diào)控。Wnt信號通路的拮抗劑，如Sfrp2、Dkk1、FrzB，在成骨細胞分化的后期表達量都明顯增多，表明一種對Wnt的負反饋調(diào)節(jié)可能控制成骨細胞成熟的最后階段。其次LRP5缺失小鼠表現(xiàn)出骨質(zhì)沉積減少。成骨細胞內(nèi)β-catenin過表達時，膠原I型a1和a2的表達量也增加。

2.1 Wnt受體LRP5對成骨細胞的影響 LRP5屬于低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白家族，是一種跨膜蛋白，編碼1 615個氨基酸。細胞外結(jié)構(gòu)主要有N末端6xYWTD重復(fù)序列和表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）樣序列構(gòu)成，這種結(jié)構(gòu)重復(fù)4次，末端連接1個低密度脂蛋白（low-density lipopro?tein receptor，LDLR）樣的配體結(jié)合區(qū)，能夠通過受體介導(dǎo)的胞吞作用與配體結(jié)合。

成骨細胞中Wnt信號通路重要性的發(fā)現(xiàn)表明Wnt受體LRP5的激活可以導(dǎo)致骨量增高，失活則可以導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥。對若干受到OPPG影響的家族和OPPG患者進行研究，發(fā)現(xiàn)LRP5缺失的突變個體會產(chǎn)生OPPG[10]。OPPG是一種罕見的可導(dǎo)致骨骼失衡和眼睛紊亂的常染色體隱性遺傳疾病，是由于LRP5基因的功能缺失導(dǎo)致的。OPPG患者的主要癥狀是骨量很低，而且有產(chǎn)生骨骼斷裂和變形的傾向。對使LRP5的功能增加的突變基因進行研究表明，LRP5功能增加的突變體的骨密度增加，具有HBM的特性[18]。對這些重要的發(fā)現(xiàn)在小鼠模型中得到進一步的確認，對小鼠進行LRP5基因敲除和引入功能增加突變會產(chǎn)生與OPPG和HBM相同的表型。對LRP5基因敲除小鼠模型的培養(yǎng)表明缺少LRP5基因時，成骨細胞的數(shù)量和增殖率會減少，而對成骨細胞的凋亡無影響[19]。缺失LRP5對成骨細胞的凋亡和分化無影響，同樣LRP5的缺失對成骨細胞的發(fā)生和骨吸收也無影響。這表明LRP5的缺失會減少小鼠的骨量是由于骨細胞的增殖和活性降低造成的。相反，對LRP5功能增強的小鼠模型LRP5G171進行研究，發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)骨量和骨強度增加，ALP活性增加，成骨細胞的凋亡減少，但細胞的活性、數(shù)量和骨吸收量無改變[5]。這說明高骨量小鼠骨組成增加是由于成骨細胞的凋亡減少成骨細胞的數(shù)量增加引起的。

2.2 β-catenin對成骨細胞的影響 β-catenin是一種與細胞黏附有關(guān)的細胞內(nèi)分子，通過與E-鈣黏著蛋白和α-catenin相互作用影響?zhàn)じ阶饔?。通過Wnt經(jīng)典通路，β-catenin在細胞質(zhì)中穩(wěn)定和積累，然后進入細胞核與LEF/TCF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合以調(diào)節(jié)Wnt通路的靶基因。在成年人體內(nèi)，β-catenin的缺失可以減少成骨細胞的數(shù)量，增加破骨細胞的數(shù)量[20]，從而影響骨的生理功能。

β-catenin在骨的發(fā)生中具有多種作用。在α1（Ⅱ）-colla?gen-Wnt14轉(zhuǎn)基因小鼠中軟骨細胞中的異位Wnt信號通路使軟骨細胞成骨增強并且抑制軟骨生成。相反，在α1（Ⅱ）-col?lagen-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠中，β-catenin失活，能夠?qū)е庐愇坏能浌切纬珊统晒羌毎姆只?。這說明由β-catenin介導(dǎo)的Wnt信號通路對成骨細胞的分化具有重要的抑制作用。但是在小鼠已分化的成骨細胞中β-catenin的缺失不會產(chǎn)生LRP5缺失時產(chǎn)生的那種表型和分子水平的異常，這種突變主要通過影響成骨細胞中骨保護素（osteoprotegerin，OPG）的形成，進而增加破骨細胞的數(shù)量，影響骨的吸收[21]。

2.3 糖原合酶激酶3（GSK-3）β GSK-3是一類絲氨酸/蘇氨酸激酶，對細胞內(nèi)的多個過程都具有調(diào)控作用[22]。在哺乳動物中有兩種亞型，α型（51 ku）和β型（47 ku）[23]。在Wnt信號通路的細胞內(nèi)影響因子中，最有可能成為藥物靶點的便是GSK-3β。GSK-3β有2個特性：一是其在細胞中一般是有活性的，主要是通過抑制其活性對其進行調(diào)節(jié)。二是它能夠優(yōu)先結(jié)合已被其他激酶磷酸化的亞基。

GSK-3β抑制劑可以誘導(dǎo)成骨細胞的分化和骨的組成，增加骨量和骨強度。在一些小鼠模型中使用GSK-3β抑制劑（如LiCl等）[11]時，骨形成會加強，骨量會增加。鋰能夠緩解LRP雙基因缺失的小鼠體內(nèi)骨質(zhì)減少的現(xiàn)象，并且可以達到與野生型骨質(zhì)水平基本一致的效果。鋰作用于野生型小鼠時，會增加其骨量。在切除卵巢的大鼠體內(nèi)給予GSK-3β抑制劑，網(wǎng)狀的皮質(zhì)骨的礦化含量和骨礦物質(zhì)密度（bone miner?al density，BMD）顯著提高。這些都表明鋰或者其他抑制劑劑對GSK-3β的修飾可能會具有治療骨質(zhì)減少的作用。

3 結(jié)論

骨的重建過程是骨的動態(tài)本質(zhì)[24]，與骨的形成過程相同，也是通過破骨細胞的吸收和成骨細胞的形成相互平衡來確保骨重建過程的正常進行。經(jīng)典Wnt信號通路可以調(diào)節(jié)成骨細胞，并且對其在成骨細胞內(nèi)的作用過程，即組成通路的成分有了一個大概的了解，對經(jīng)典Wnt信號通路如何影響成骨細胞的增殖和分化雖然有了基礎(chǔ)的認識，但是隨著對信號通路的深入探索，發(fā)現(xiàn)與此通路相關(guān)的成分越來越多，很多問題還有待解決。

[1]Laudes M.Role of Wnt signalling in the determination of human mesenchymal stem cells into preadipocytes[J].J Mol Endocrinol,2011,46(2):R65-72.

[2]Yavropoulou MP,Yovos JG.The role of the Wnt signaling pathway in osteoblast commitment and differentiation[J].Hormones,2007,6(4):279-294.

[3]Verkaar F,van der Stelt M,Blankesteijn WM，etal.Discovery of novel small molecule activators ofβ-catenin signaling[J].PLoSOne,2011,6(4):e19185.

[4]Wang X,Wiens M,Schr?der HC,etal.Evagination of cells controls bio-silica formation and maturation during spicule formation in sponges[J].PLoSOne,2011,6(6):e20523.

[5]Bodine PV.Wnt signaling control of bone cell apoptosis[J].Cell Res,2008,18(2):248-253.

[6]Carthy JM,Garmaroudi FS,Luo Z，etal.Wnt3a induces myofibro?blast differentiation by upregulating tgf-βsignaling through smad2 in aβ-catenin-dependent manner[J].PLoSOne,2011,6(5):e19809.

[7]Liu Y,Rubin B,Bodine PV,etal．Wnt5a induces homodimeriza?tion and activation of Ror2 receptor tyrosine kinase[J].J Cell Bio?chem,2008,105(2):497-502.

[8]Baron R,Rawadi G.Targeting the Wnt/beta-catenin pathway to reg?ulate bone formation in the adult skeleton[J].Endocrinology,2007,148(6):2635-2643.

[9]MacDonald BT,Tamai K,He X.Wnt/β-catenin signaling:compo?nents,mechanisms,and diseases[J].Dev Cell,2009,17(1):9-26.

[10]Bodine PV,Komm BS.Wnt signaling and osteoblastogenesis[J].Rev Endocr Metab Disord,2006,7(1-2):33-39.

[11]Li HX,Luo X,Liu RX，etal.Roles of Wnt/beta-catenin signaling in adipogenic differentiation potential of adipose-derived mesenchy?mal stemcells[J].Mol Cell Endocrinol,2008,291(1-2):116-124.

[12]Zeng X,Huang H,Tamai K,et a1．Initiation of Wnt signaling:con?trol of Wnt coreceptor Lrp6 phosphorylation/activation viafrizzled,di?shevelled and axin functions[J].Development,2008,135(2):367-375.

[13]Mao W,Wordinger RJ,Clark AF.Functional analysis of disease-as?sociated polymorphism LRP5[J].Mol Vis,2011,17:894-902.

[14]Sem?nov MV,Zhang X,He X.DKK1 antagonizes Wnt signaling without promotion of LRP6 internalization and degradation[J].JBi?ol Chem,2008,283(31):21427-21432.

[15]Wu G,Huang H,Garcia Abreu J，etal．Inhibition of GSK3 phos?phorylation of beta-catenin via phosphorylated PPPSPXSmotifs of Wnt coreceptor LRP6[J].PLoSOne,2009,4(3):e4926.

[16]Shi YC,Worton L,Esteban L,etal．Effects of continuous activa?tion of vitamin D and Wnt response pathways on osteoblastic prolif eration and differentiation[J].Bone,2007,41(1):87-96.

[17]Stevens JR,Miranda-Carboni GA,Singer MA，etal.Wnt10b defi?ciency results in age-dependent loss of bone mass and progressive reduction of mesenchymal progenitor cells[J].J Bone Miner Res,2010,25(10):2138-2147.

[18]Macsai CE,Foster BK,Xian CJ.Roles of Wnt signalling in bone growth,remodelling,skeletal disorders and fracture repair[J].JCell Physiol,2008,215(3):578-587.

[19]Qiang YW,Hu B,Chen Y,etal．Bortezomib induces osteoblast dif?ferentiation via Wnt-independent activation of beta-catenin/TCF signaling[J].Blood,2009,113(18):4319-4330.

[20]Glass DA 2nd,Karsenty G.In vivo analysis of Wnt signaling in bone[J].Endocrinology,2007,148(6):2630-2634.

[21]Milat F,Ng KW.Is Wnt signalling the final common pathway leading toboneformation[J]?Mol Cell Endocrinol,2009,310(1-2):52-62.

[22]Tullai JW,Tacheva S,Owens LJ，etal.AP-1 Is a component of the transcriptional network regulated by gsk-3 in quiescent cells[J].PLoSOne,2011,6(5):e20150.

[23]Wu D,Pan W.GSK3:a multifaceted kinase in Wnt signaling[J].Trends Biochem Sci,2010,35(3):161-168.

[24]Sims NA,Gooi JH.Bone remodeling:Mutiple cellular interactions re?quired for coupling of bone formation and resorption[J].Semin Cell Dev Biol,2008,19(5):444-451.