朊病毒病治療的研究進(jìn)展

張珠明，汪仁莉，趙德明

（1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系，寧夏 銀川750021；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 國家動(dòng)物海綿狀腦病實(shí)驗(yàn)室，北京 海淀100193）

世界衛(wèi)生組織曾預(yù)言，到2040年，最常見的致死性疾病中，神經(jīng)退行性疾病將會(huì)攀升至第二位，僅次于癌癥。在這類疾病中，朊病毒病是惟一能通過動(dòng)物模型直接探尋體內(nèi)病理學(xué)機(jī)理的一種。朊病毒病是由朊病毒引起人和動(dòng)物出現(xiàn)以中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變?yōu)樘卣鞯囊活惣膊?，主要包括人的庫魯病、克雅氏病、致死性家族性失眠，牛的海綿狀腦病、綿羊和山羊的癢病、鹿科動(dòng)物的慢性消耗性疾病等等。目前認(rèn)為該類疾病的病原朊病毒是一種不含核酸的蛋白顆粒，是機(jī)體內(nèi)正常朊蛋白PrPC發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)化錯(cuò)誤折疊形成的異常朊蛋白PrPSc。朊病毒在形態(tài)上是一種蛋白聚集物，感染機(jī)體后，不能被體內(nèi)的蛋白酶消化清除，也不會(huì)引起機(jī)體的免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，因此不易早期發(fā)現(xiàn)和進(jìn)行治療。多年來，研究朊病毒病的科學(xué)家們一直致力于該病的發(fā)病機(jī)制和治療方面的研究，希望通過體外或體內(nèi)試驗(yàn)找出抑制朊病毒轉(zhuǎn)化、增殖或轉(zhuǎn)移的方法，但仍然沒有一種藥物足夠有效地預(yù)防和治療這類疾病。朊病毒在機(jī)體內(nèi)復(fù)制的分子基礎(chǔ)是PrPC與PrPSc間構(gòu)象轉(zhuǎn)化，故而阻斷PrPC向著PrPSc轉(zhuǎn)化是朊病毒病治療的一個(gè)切入點(diǎn)。此外，朊病毒病主要特征是朊病毒在中樞神經(jīng)系統(tǒng)聚集，引起患病個(gè)體腦組織的病理變化，因此，減少PrPSc的蓄積也是治療過程中經(jīng)?？紤]到的另外一個(gè)方面。故而，用于治療的藥物如果能夠突破血腦屏障（brain－blood barrier，BBB）進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)（centre nerves system，CNS），或者直接將藥物引入到腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）或腦組織，從這兩個(gè)方面入手都有可能起到延緩疾病發(fā)生的作用。目前為止，在朊病毒病的治療方面取得的進(jìn)展主要有以下幾點(diǎn)。

1 化學(xué)治療

化學(xué)治療常常使用一些具有抗朊病毒作用的化合物，包括聚陰離子化合物硫酸肝素、粘多糖以及粘多糖類似物剛果紅、四環(huán)類化合物（如四環(huán)素，強(qiáng)力霉素）、多烯類抗生素（如兩性霉素B）、阻斷β－折疊形成的多肽類（如小鼠或倉鼠的朊蛋白多肽PrP119－136）等［1］。環(huán)己二胺四乙酸二鈣鈉能通過螯合感染 M1000的Balb／c小鼠腦內(nèi)的 Mn2＋進(jìn)而減少PrPSc的含量［2］。羥乙基哌嗪乙硫磺酸的體外試驗(yàn)中，對(duì)感染朊病毒的細(xì)胞有明顯地抑制PrPSc的蓄積作用，而且這種抑制有濃度依賴性［3］。

這些抗朊病毒的化合物在體外選擇性地與PrPC或PrPSc靶向結(jié)合，或靶向作用于PrPC→PrPSc的轉(zhuǎn)化過程，阻止PrPC轉(zhuǎn)化成PrPSc，從而抑制了朊病毒的增殖。然而，這些物質(zhì)在體外培養(yǎng)接種朊病毒的細(xì)胞模型中有效，有的且對(duì)動(dòng)物模型有毒性，或在體內(nèi)治療效率極低，甚至無效［4］。

2 LRP／LR受體特異性抗體治療

至今發(fā)現(xiàn)的朊蛋白細(xì)胞表面受體有很多種，近年來，朊蛋白37－kDa／67－kDa層粘連蛋白受體及其前體（LRP／LR）備受關(guān)注，體外證明該受體是朊病毒分子PrPSc在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和聚集所必需的蛋白。因此，在理論上利用LRP／LR的特異性抗體與LRP／LR蛋白特異性結(jié)合可以抑制或者阻斷PrPSc在細(xì)胞內(nèi)的聚集。體外試驗(yàn)已證明Anti－LRP／LR抗體W3可以抑制PrPSc在感染癢病病毒的神經(jīng)細(xì)胞ScN2a內(nèi)的聚集［5］；在體內(nèi)試驗(yàn)中，將 LRP／LR的重組單鏈抗體片段（single chain antibodies，scFV）注射免疫C57BL／6小鼠后，降低了PrPSc在外周組織內(nèi)的增殖，且明顯延長(zhǎng)了小鼠的臨床發(fā)病潛伏期［6］。利用基因工程的方法，將表達(dá)LRP／LR抗體scFV的基因克隆到改造的腺病毒（adeno－associated virus，AAV）基因內(nèi)，然后將組裝成的AAV擴(kuò)增子經(jīng)腦內(nèi)注射到C57BL／6小鼠的海馬，使LRP／LR的抗體scFV基因在體內(nèi)得到表達(dá)。產(chǎn)生的LRP／LR抗體scFV與層粘連蛋白的特異性結(jié)合能夠抑制PrPSc在小鼠外周組織細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制和增殖，延長(zhǎng)了小鼠的臨床發(fā)病潛伏期，而且在該小鼠脾臟內(nèi)也檢測(cè)到了AAV基因［7］。這表明朊蛋白特異性受體LRP／LR抗體的應(yīng)用可以作為朊病毒病治療的一種手段。此外，以腺病毒基因作為載體運(yùn)載的表達(dá)LRP／LR的抗體scFV的基因能夠在機(jī)體各組織中分布，且能產(chǎn)生有效的主動(dòng)免疫抗體，也可以作為朊病毒病的一種潛在治療方法。

3 RNA干擾

RNA干擾是翻譯后修飾水平上沉默內(nèi)源性基因最有力的技術(shù)。在幾種神經(jīng)退行性疾病的動(dòng)物模型中已經(jīng)表現(xiàn)出治療的潛力。慢病毒介導(dǎo)的抗PrP的shRNA的表達(dá)有效地抑制了朊病毒的復(fù)制延長(zhǎng)了癢病感染小鼠的存活時(shí)間［8］。慢病毒載體介導(dǎo)的LRP／LR基因特異的干擾siRNA腦內(nèi)注射癢病毒株RML感染的LC57BL／6小鼠后，也能夠延長(zhǎng)小鼠的臨床發(fā)病潛伏期［9］。RNA干擾已成為神經(jīng)類疾病極有效的治療方法。

4 免疫治療

朊病毒不能引起機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生主動(dòng)免疫抗血清，因此不能夠利用疫苗來治療。最早提出的朊病毒病抗體治療方法是基于1988年的一項(xiàng)體外研究：體外感染癢病病毒的細(xì)胞與抗PrP抗體孵育一段時(shí)間后降低了該細(xì)胞的傳染性［10］。已有研究發(fā)現(xiàn)，PrP抗體在體外培養(yǎng)的細(xì)胞模型和動(dòng)物模型體內(nèi)都可以降低朊病毒的感染性。PrP抗體以及重組的抗原結(jié)合片段（antigen－binding fragment，F(xiàn)ab）可以抑制朊病毒在ScN2a細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制和增殖。抗PrP中間片段的抗體（PrP90－110，132－156）不僅可以有效抑制癢病病毒感染細(xì)胞，還能降低感染鼠脾臟內(nèi)的PrPSc［11］。RML朊病毒株感染的小鼠如果在早期就應(yīng)用單克隆抗體ICSM35（PrP143－153）和ICSM18（PrP93－105）進(jìn)行干預(yù)，能夠減弱發(fā)病狀況，并且沒有副作用［12］。

抗體治療方法已經(jīng)成為朊病毒病治療研究的一個(gè)挑戰(zhàn)。大量體外試驗(yàn)研究已經(jīng)證明，PrP抗體具有抗朊病毒效果，但是在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行應(yīng)用時(shí)，還要考慮抗體分子大小、抗體給予途徑、抗體在機(jī)體內(nèi)的擴(kuò)散性等因素。

4.1 不同類型的抗體 在動(dòng)物模型體內(nèi)，直接注射抗PrP全長(zhǎng)的抗體分子可以降低朊病毒感染性，但是由于全長(zhǎng)抗體IgG分子量很大，不易穿過血管進(jìn)入組織，尤其難以穿過BBB，進(jìn)入腦組織。此外，機(jī)體內(nèi)存在復(fù)雜的生物級(jí)聯(lián)反應(yīng)對(duì)抗體的應(yīng)用也造成了一定的困擾，例如，研究發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)注射抗PrP的IgG抗體之后，IgG與PrPC的交聯(lián)作用在體內(nèi)造成了海馬神經(jīng)元和小腦神經(jīng)元的死亡［13］。而且由于全長(zhǎng)抗體在機(jī)體內(nèi)擴(kuò)散性能較差，如果用以治療朊病毒病，只有在外周感染的同時(shí)或感染之后立即注射抗體，才能夠阻止朊病毒從外周組織轉(zhuǎn)移到CNS，在一定程度上抑制其致病性?；谌L(zhǎng)抗體分子較大，有人又研究出了單價(jià)小分子抗體片段Fab，但是Fab也不易穿過BBB。因此，全長(zhǎng)的抗體和Fab都不宜直接注射到動(dòng)物體內(nèi)，以產(chǎn)生被動(dòng)免疫來預(yù)防和治療朊病毒病。另外還有一種可變區(qū)的scFV，這是一種單價(jià)小抗體，只含抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)，兩個(gè)可變區(qū)之間由一段融合多肽連接。這種抗體保留了抗原結(jié)合特異性，且應(yīng)用基因工程的手段能夠使scFV在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)并被分泌到細(xì)胞外。Campana等人分別利用重組的病毒基因載體AAV和慢病毒將重組的朊蛋白抗體D18scFV轉(zhuǎn)染到ScN2a細(xì)胞和scGT1細(xì)胞內(nèi)，結(jié)果AAV－D18scFV和慢病毒－D18scFV都降低了細(xì)胞內(nèi)PrPSc的量［14］。

4.2 抗體在機(jī)體內(nèi)的擴(kuò)散性 動(dòng)物機(jī)體通過直接注射的抗體能夠獲得被動(dòng)免疫，該類抗體在機(jī)體內(nèi)的擴(kuò)散性不好，通常難以穿過血管進(jìn)入到機(jī)體各組織，尤其難以進(jìn)入CNS。因而，抗體能夠在機(jī)體內(nèi)擴(kuò)散是抗體治療朊病毒病的關(guān)鍵條件。全長(zhǎng)抗體和Fab在體內(nèi)的擴(kuò)散性不好，而病毒基因載體運(yùn)輸scFV的方法能夠產(chǎn)生較好的擴(kuò)散性，如改造的AAV、HSV或lentivirus可以攜帶scFV抗體基因在機(jī)體組織內(nèi)擴(kuò)散，并能夠穿過BBB。與IgG和Fab相比，scFV抗體具有更廣泛的應(yīng)用價(jià)值。Wuertzer等人利用重組的AAV2作為病毒載體運(yùn)輸D18scFV抗體到朊病易感小鼠的CNS內(nèi)，同時(shí)外周接種感染朊病毒，明顯延遲了小鼠的臨床發(fā)病潛伏期，且免疫組化和Western blot結(jié)果顯示CNS內(nèi)PrPSc的量降低［15］。值得注意的是，應(yīng)用病毒載體使朊病毒抗體進(jìn)入到腦組織內(nèi)的方法并不可能完全阻止朊病毒感染，因?yàn)閭魅拘噪貌《镜膹?fù)制主要發(fā)生在外周淋巴組織內(nèi)，PrPSc仍然能夠在外周組織內(nèi)復(fù)制，并可能通過神經(jīng)入侵的方式從外周組織轉(zhuǎn)移到CNS。由于PrPC→PrPSc的蛋白結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化過程還未完全弄清楚，對(duì)于抗體治療方法，要找到確切的、能夠特異性阻斷朊病毒增殖的抗體，并且要使抗體能夠在機(jī)體組織內(nèi)擴(kuò)散，穿過BBB在CNS內(nèi)擴(kuò)散，還需要大量的科學(xué)試驗(yàn)來不斷研究和探索。

4.3 抗體的被動(dòng)免疫和主動(dòng)免疫 直接給動(dòng)物注射抗體用以治療朊病毒病時(shí)，要生產(chǎn)大量的單抗，而生產(chǎn)單抗對(duì)生物學(xué)技術(shù)的要求較高，且需要大量的經(jīng)費(fèi)。因此，為了研究出一種真正具有可行性的治療方法，科學(xué)家們結(jié)合被動(dòng)免疫和主動(dòng)免疫，研究出了一種由病毒基因載體運(yùn)載的靶向結(jié)合PrP抗體的治療方法，該方法中將朊病特異抗體的單價(jià)小抗體分子scFV基因克隆到病毒載體如AAV、慢病毒或單純皰疹病毒（Herpes simplex virus，HSV），然后經(jīng)病毒包被將組裝成的病毒擴(kuò)增子注射到動(dòng)物體內(nèi)，使scFV抗體在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)長(zhǎng)期表達(dá)，并保持其免疫特異性。這種方法產(chǎn)生的scFV特異抗體能夠被分泌到細(xì)胞外，且能從注射部位擴(kuò)散到機(jī)體其他部位，并穿過BBB在CNS內(nèi)擴(kuò)散，達(dá)到了主動(dòng)免疫治療目的，克服了前面提到的被動(dòng)免疫擴(kuò)散性差的弊端。此外，病毒基因作為載體運(yùn)輸抗體基因已成為一種有前景的治療手段，用于治療多種神經(jīng)退行性疾病，如利用HSV基因載體治療帕金森病。

綜上所述，科學(xué)家已經(jīng)在朊病毒病治療方面的研究上做了很多努力，這些發(fā)現(xiàn)開創(chuàng)了朊病毒病和其他神經(jīng)退行性疾病治療領(lǐng)域的一個(gè)新途徑。雖然取得了一定的成果，但很多結(jié)論都是基于試驗(yàn)動(dòng)物模型得到，至今仍未發(fā)現(xiàn)能應(yīng)用于市場(chǎng)的有效藥物或治療方法。因此，仍然需要科學(xué)的不斷創(chuàng)新和探索，繼續(xù)研究PrPC→PrPSc的轉(zhuǎn)化過程，PrPSc的轉(zhuǎn)運(yùn)和清除作用，這樣才能夠在朊病毒病治療上有更大的突破。

［1］Trevitt C R，Collinge J.A systematic review of prion therapeutics in experimental models［J］.Brain，2006，129：2241－2265.

［2］Sim V L，Caughey B.Recent advances in prion chemotherapeutics［J］.Infectious Disorders－Drug Targets，2009，9（1）：81－91.

［3］Brazier M W，Volitakis I，Kvasnicka M，etal.Manganese chelation therapy extends survival in a mouse model of M1000 prion disease［J］.J Neurochemistry，2010，114（2）：440－451.

［4］Ludewigs H，Zuber C，Vana K，etal.Therapeutic approaches for prion disorders［J］.Expert Rev Anti Infect Ther，2007，5（4）：613－630.

［5］Zuber C，Mitteregger G，Pace C.Anti－LRP／LR Antibody W3 Hampers Peripheral PrPScPropagation in Scrapie Infected Mice［J］.Prion，2007，1（3）：207－212.

［6］Zuber C，Knackmussb S，Rey C，etal.Single chain Fv antibodies directed against the 37kDa／67kDa laminin receptor as therapeutic tools in prion diseases［J］.Mol Immunol，2008，45：144－151.

［7］Zuber C，Mitteregger G，Schuhmann N，etal.Delivery of single－chain antibodies（scFvs）directed against the 37／67kDa laminin receptor into mice via recombinant adeno－associated viral vectors for prion disease gene therapy［J］.J Gen Virol，2008，89：2055－2061.

［8］Pfeifer A.Lentivector－mediated RNAi efficiently suppresses prion protein and prolongs survival of scrapie－infected mice［J］.J Clin Invest，2006，116（12）：3204－3210.

［9］Pflanz H.Microinjection of lentiviral vectors expressing small interfering RNAs directed against laminin receptor precursor mRNA prolongs the pre－clinical phase in scrapie－infected mice［J］.J Gen Virol，2009，90：269－274.

［10］Gabizon R.Immunoaffinity purification and neutralization of scrapie prion infectivity［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1988，85：6617－6621.

［11］White A Rl.Monoclonal antibodies inhibit prion replication and delay the development of prion disease［J］.Nature，2003，422：80－83.

［12］Carswell C.PAW35Anti－prion protein monoclonal antibodies at low doses effectively treat prion disease in mice without sideeffects［J］.J Neurol Neurosurg Psychiatry，2010，81（11）：33.

［13］Solforosi L.Cross－linking cellular prion protein triggers neuronal apoptosis in vivo［J］.Science，2004，303：1514－1517.

［14］Campana V.Development of antibody fragments for immunotherapy of prion diseases［J］.Biochem J，2009，418：507－515.

［15］Wuertzer C A，Sullivan M A，Qiu X，etal.CNS Delivery of Vectored Prion－specific Single－chain Antibodies Delays Disease Onset［J］.Mol Ther，2008，16（3）：481－486.