小腦星形膠質細胞功能的最新進展

楊昌建 戴澤平

（皖南醫(yī)學院附屬弋磯山醫(yī)院麻醉科，安徽 蕪湖 241001）

在雙光子顯微鏡和熒光鈣指示器的多細胞藥物負荷幫助下，我們對星形膠質細胞的功能認識已發(fā)生飛躍。最近，大多數研究集中在大腦皮質的星形膠質的功能。這些研究證實：星形膠質細胞隨鈣離子濃度的增加，經須偏離圓柱皮質而選擇視皮質。癲癇發(fā)作后，病態(tài)腦中的鈣信號是增強的[1]。其他非成像研究證實：星形膠質細胞通過皮質緩慢震動的作用[2]來調節(jié)睡眠[3]，顯示出晝夜節(jié)律性。皮質星形膠質細胞的研究飛速發(fā)展，但是很少人知道它們的信號和功能。這篇綜述將介紹在成人小腦皮質的星形膠質的知識和一些可用的工具，方法研究它們的功能。

1 小腦皮質放射狀的星形膠質細胞：伯格曼膠質細胞

小腦皮質的BG星形膠質細胞和顆粒細胞叢原漿性星形膠質細胞都被描述。BG細胞是放射狀的神經膠質，在早期發(fā)育時引導顆粒細胞的遷移[4]。在成人中相當于底部分子層的星形膠質細胞的功能。BG細胞位于浦肯野細胞（PC）四周，圍繞PC形成菊花團，在數量上超過PC，達到8:1。每個BG細胞多達5個垂直蔓延到分子層的主干，終杻在軟膜表面[5]，終止于球狀頂端。不重疊的構造區(qū)域觀察到皮質星形并不出現在小腦的分子層上[6]。相反，BG細胞主干大量重疊。BG細胞在平面上是定向的，因為PC呈樹枝狀的。許多BG細胞重疊形成神經膠質柵欄，它們是橫向，定向的（平行纖維），而且旁邊突出物突出主干，這些主干來源于小復合體。這些主干在BG細胞和小腦神經元中激活并區(qū)分信號肽[7]，較小的主干環(huán)繞平行纖維，脊樹突在神經元上分化成數百個微小投射，并排列成功能性領域的中間神經元與許多突觸，它們之間相互環(huán)繞。在分子水平上，BG細胞主干神經元的構造表明他們機能地相互作用并顯示小腦的功能。

谷氨酰天冬氨酸轉運蛋白（GLAST）在BG細胞主干上濃密的表達，谷氨酸鹽在細胞外間隙濃度提高，精確到微秒[8]，以致足夠時間激動數百微摩爾的a-氨基羥甲基惡唑丙酸（AMPA）受體[9]。AMPA受體介導的量子事件能更深遠的判斷谷氨酸鹽的瞬間變化，從而顯示出谷氨酸鹽釋放途徑：由突觸前的神經元直接并列到AMPA受體上。

體外研究表明：平行纖維和垂直纖維同時依賴激活的AMPA受體類型，BG細胞的AMPA受體介導的趨勢電流經歷短期適應性。BG細胞的AMPA受體缺少G-2亞基[10]，主要依賴鈣的通透性[11]，因此，在光學上測量AMPA受體需要鈣信號介導。事實上，體外研究證實少部分的AMPA受體突觸激發(fā)鈣信號[12]，BG細胞小復合體阻斷AMPA受體，同樣阻斷鈣信號。而且，在PC的突觸中，隨鈣通透性的降低，AMPA受體在BG細胞主干中減少，導致反常神經支配縱形纖維。通過鈣通透性的超表達，AMPA受體在BG細胞主干中增多[13]。集中在BG細胞主干上的r-氨基丁酸受體抑制突觸傳遞，這表明BG既能興奮突觸傳遞還能抑制突觸傳遞，BG細胞的不同部位有不同的突觸類型，因此有不同的功能。它們在BG細胞中聯合起作用的。

利用轉基因病毒技術，熒光鈣傳感蛋白的鑲嵌表達來研究鈣信號，它包括局限在BG亞細胞內的鈣信號，通過谷氨酸釋放突觸驅使的。這樣的信號與麻醉深度起相反的作用。它有可能增加清醒動物的神經元活動的頻率。僅輕微增加異氟烷的麻醉深度，可以顯著降低相鄰神經元的活動。清醒小鼠可通過谷氨酸受體拮抗劑和河豚毒同樣阻斷BG信號[14]。

除親離子受體，BG同樣表達G蛋白耦合受體，它可使細胞內儲存的鈣發(fā)生變化。嘌呤能受體的小分子團和P2Y核苷酸受體是促代謝的受體，傳導細胞內的鈣信號，引起星形細胞鈣波傳播[15]。小腦中的這種機制用于表達信號。功能領域包括小部分中間神經元和PC細胞。我們在小腦中發(fā)現P2Y核苷酸受體拮抗劑PPADS和舒拉明可阻斷放射狀的鈣波。在體內ATP觸發(fā)數百萬個BG主干的放射狀的鈣波，這種波在低濃度異氟烷麻醉下有0～80mHz/mm2。這種波在分子層面由許多部位引起的，但是自發(fā)的波來自同一部位，說明那里有波源。目前，小腦膠質細胞波的起源和終止并不知道。通過激活P2Y受體的活動，星形膠質細胞釋放的ATP可以增加海馬中間神經元的興奮性[16]。這種放射狀的波有可能觸發(fā)ATP輻射源的釋放，能夠改變中間神經元的興奮性，相反，中間神經元可能擔當ATP的角色，BG細胞主干觸發(fā)神經膠質鈣信號的傳播。在視光膜上LE細胞中使離子沉淀，有規(guī)律調節(jié)細胞外的K+，還可能調節(jié)中間神經元和PC細胞的興奮性。ATP同樣所觸發(fā)完整的LE細胞中放射狀的鈣波[17]。雖然知道在星形膠質細胞中增加鈣需要血流速度調節(jié)[18]。它仍然需要研究：放射狀的波是否需要同樣的作用？體內BG細胞鈣信號局限地擴散有不同的作用：下游區(qū)影響興奮性和血流速度，還可能參與神經保護。實驗證實，視網膜上LE細胞的波的傳播引起血管收縮[17]。

最新進展認為活動的小鼠的神經元和星形膠質細胞的大規(guī)模成像要優(yōu)于麻醉的動物，通過固定小鼠的頭部觀察小腦中的鈣的改變。研究表明：在皮質星形細胞中運動與鈣離子增加是有關聯的。在小腦中我們觀察到整個領域鈣離子濃度增加，它包括BG主干的開始端。Nimmerjahn等人證明這樣的鈣變化能敏感的阻斷神經元的活動和血流速度。仍不清楚的是，BG激活平行纖維，縱形纖維的活動類型是否相符合。BG微小區(qū)域的平行纖維的興奮性引起鈣變化，但是不能觸發(fā)鈣波。在BG細胞中觀察到三個特殊的鈣信號：他們是高度區(qū)別的，都是通過突觸相互作用的，放射狀波穿過復雜的BG主干（數萬個）。在活動中觀察到許多BG主干（數百個）同時活動。將來研究這個小腦皮質的神經元與神經膠質相互作用的信號肽所有成分和信息。

2 有緣膜的星形膠質細胞：原漿性星形細胞

與BG相比，顆粒細胞的原漿性星形細胞有星狀的表面，更類似于皮質星形細胞，但是很少人知道它們的功能。光學和電子顯微鏡已經顯示它們的形狀。構造上分為神經纖維球和顆粒細胞[19]。

腺病毒感染的重組體產生亞細胞的鈣信號，該信號約持續(xù)3秒鐘，當被ATP激活時自發(fā)地在細胞之間傳播后，原漿性星形細胞則表達特殊的熒光性鈣指示蛋白G-CaMP2。這種性質在分子水平上類似BG細胞。未來研究將闡明原漿性星形細胞在亞細胞或在細胞之間局限擴散的過程。原漿性星形細胞在分子水平上通過神經突觸的局部作用來控制信息功能（例如谷氨酸鹽清除率）。

3 在完整小腦的星形膠質細胞中測量鈣信號

上述星形膠質細胞功能的發(fā)現是隨著新穎的基因工具和成像技術而出現的。一個重要的突破，體內鈣信號成像與雙光子激光顯微掃描術是伴隨而生的，可以更深度解決腦中高度散布的樣本成像和多細胞藥物負荷合成的熒光粘附酯-鈣指示染料的問題[20]。在腦實質中注入該染料，成千上萬神經元和膠質細胞有計劃的聚集在至少直徑幾百微米的區(qū)域。這種非特異的成像技術用于各種細胞吸收染料。它提供信號的本質特征。因素取決于細胞類型包括著色方法、注射深度、以及染料使用的類型（例如，Fluo-4/AM，Fluo-5F/AM，或者格林BAPTA-1/AM）。通常區(qū)別神經元和膠質細胞的方法是共同注入綠熒光染料，星形膠質細胞標志物SR101顯示紅熒光[21]。這種方法促使神經元與膠質細胞的鈣信號的研究，綠色的功能信號從紅色的結構信號中分離出來。盡管這項技術很有用，但是分離技術的使用仍受限。

星形膠質細胞亞群表達FCIPs[22]，它可以解決這個問題。由膠質纖維酸性蛋白（GFAP）和GLAST發(fā)起的，FCIP的基因密碼引入細胞內，確保蛋白質在細胞內表達。

在體神經元和星形膠質細胞，有四種方法用于FCIPs的基因：轉基因技術，細胞內電穿孔，單細胞穿孔和重組病毒。目前為止只有重組病毒成功用于成像技術。病毒載體發(fā)展人類基因理論：病毒不完全閉鎖復制和宿主最低中毒。這些病毒載體整合它們的基因到宿主細胞，而其他傳遞基因瞬間表達保留則在染色體外。在星形膠質細胞，病毒類型用于傳遞FCIPs基因。不穩(wěn)定表達持續(xù)數周，允許膠質細胞信號的長期成像。腹腔內注射甘露醇后，細胞外隙空間變大，有利于病毒的蔓延和蛋白質的表達[23]。

許多病毒家族和血清型用于感染星形膠質細胞。腺病毒運載體用于星形細胞的基因改變[24]。在巨細胞電游上皮的啟動子啟動下，我們使用腺病毒完全重組體AdEasy-1來表達FCIPs-G-CaMP2。腺病毒感染神經膠質細胞的能力強于神經元[25]，巨細胞病毒電泳上皮啟動子的表達水平也是神經膠質強于神經元[26]。由于雙重表達，BG細胞和原漿性星形細胞限制G-CaMP2的表達。使用這種方法，我們知道星形細胞1～25d的鈣信號。

病毒控制FCIPs的表達水平，在星形膠質細胞中轉基因鼠表達的FCIPs的使用允許非侵襲成像和長期成像，已經超過當前使用病毒方法，但是FCIPs的表達是有限的，沉默子阻止FCIPs的表達。

4 前景與展望

在小腦中，BG信號與運動有關，并且敏感阻斷神經元的活動。在活動老鼠小腦星形細胞中，鈣傳感探頭拓展了單天的到數天，周的膠質細胞信號的研究。更多的實驗細節(jié)被要求：哪種神經元刺激體內的BG細胞及影響下游的興奮性。轉基因動物何處膠質被阻斷，將提供必要的工具來解決這個問題。另外的工具研究星形膠質細胞對下游神經的影響，這個工具就是CHR2，它是單價和二價陽離子通道。在星形膠質細胞中該通道選擇性的表達與FCIPs一樣。神經元表達CHR2的特殊亞群的活動影響膠質細胞的活動。但是原漿性星形細胞的功能很大程度上被忽視。病毒基礎研究方法將有助于揭示小腦網絡功能。

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