豬膽汁中三種主要膽汁酸的提取分離

鄧啟華，姚 穎，劉 婷，敬玲玲，李子成

(1.四川化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院 制藥與環(huán)境工程系，四川 瀘州 646005;2.四川大學(xué) 化工學(xué)院，四川 成都 610065)

豬膽汁中三種主要膽汁酸的提取分離

鄧啟華1，姚 穎2，劉 婷2，敬玲玲2，李子成2

(1.四川化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院 制藥與環(huán)境工程系，四川 瀘州 646005;2.四川大學(xué) 化工學(xué)院，四川 成都 610065)

目的 從提取膽紅素下腳料中同時(shí)提取三種膽汁酸。方法 混合豬膽汁酸粗品在硫酸催化下形成甲酯，利用豬去氧膽酸甲酯與苯形成的加合物不溶于苯的性質(zhì)將其分離出來;用乙酸酐將剩余膽汁酸甲酯中的所有羥基轉(zhuǎn)化為乙酸酯，利用豬膽酸甲酯三乙酸酯在正己烷中溶解度低的性質(zhì)，使其分離，最后用無水乙醇結(jié)晶分離出鵝去氧膽酸甲酯二乙酸酯。所得各種豬膽汁酸酯經(jīng)乙醇-NaOH溶液水解得到純豬去氧膽酸、豬膽酸和鵝去氧膽酸，并對(duì)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征，純度經(jīng)HPLC測(cè)定均大于98%。結(jié)果 通過一次工藝流程分離出三種膽酸，含量均大于98%。結(jié)論 該提取工藝提高了原料的利用率，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

豬膽汁酸;豬去氧膽酸;鵝去氧膽酸;豬膽酸;提取;分離

膽汁酸是膽汁的主要成分，約占膽汁總量的50% ～70%，主要由豬去氧膽酸、豬膽酸、鵝去氧膽酸、3α-羥基-6-氧-5α-膽烷酸以及膽石酸等組成，其中豬去氧膽酸約占40%，鵝去氧膽酸約占25%。目前，豬膽汁的利用主要是提取豬去氧膽酸或鵝去氧膽酸，但很少有工藝能一次性將豬膽汁中的幾個(gè)成分分離［1-3］。在提取豬去氧膽酸時(shí)主要采用大量乙酸乙酯進(jìn)行提取和純化，所得產(chǎn)品純度低。也有對(duì)乙酸乙酯提取物采用丙酮重結(jié)晶法，甲醇(或乙醇)-水重結(jié)晶法等，但需要使用大量有機(jī)溶劑，而且生產(chǎn)周期長(zhǎng)，不能大規(guī)模生產(chǎn)。鵝去氧膽酸的提取主要采用鋇鹽沉淀法［4］，結(jié)晶提取法［5］、離子交換樹脂法，這些方法提取收率低，純度僅90%左右。

本研究參考文獻(xiàn)［6］，先將豬總膽汁酸甲酯化，得到混合膽酸甲酯，加入苯或甲苯以加合物的形式分離出豬去氧膽酸甲酯;剩下的成分用乙酸酐將膽酸甲酯中含有的羥基全部乙?；?，再根據(jù)它們?cè)谡和榛蚴兔阎械娜芙庑圆町惣右苑蛛x，得到豬膽酸甲酯三乙酸酯，最后再用乙醇將鵝去氧膽酸甲酯二乙酸酯結(jié)晶析出。這樣不僅得到豬去氧膽酸甲酯，還有豬膽酸甲酯三乙酸酯及鵝去氧膽酸甲酯二乙酸酯，再分別進(jìn)行水解即得到豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸和豬膽酸。該法不僅高效地得到了高純度的豬去氧膽酸，還得到了高純度的豬膽酸和鵝去氧膽酸，提高了豬膽汁的綜合利用效率。

1 材料

混合豬膽汁酸為四川弘茂制藥有限公司皂化后粗品。所用試劑和溶劑均為分析純。

Yanaco顯微熔點(diǎn)儀(溫度未經(jīng)校正);AllTech hplc 426，Alltech ELSD2000蒸發(fā)光散射檢測(cè)器;Varian INOVA 400高分辨率核磁共振波譜儀(溶劑DMSO-d6，TMS作內(nèi)標(biāo));A12630 APIV/6W 自動(dòng)旋光儀;Finnigan LCQDECA型質(zhì)譜儀。

2 方法

2.1 混合膽汁酸的甲酯化和豬去氧膽酸的提取

在1 L燒瓶中加入混合膽汁酸粗品100 g，甲醇500 mL，攪拌溶解后，緩慢滴加硫酸7 mL，并于室溫下攪拌24 h，薄層色譜(TLC)監(jiān)測(cè)反應(yīng)完畢。以無水NaHCO3固體調(diào)pH至中性，過濾掉無機(jī)鹽，濾餅用甲醇洗滌，合并濾液及洗液，減壓回收甲醇，得棕褐色黏稠狀物，加水100 mL溶解其中的無機(jī)鹽，再以乙醚提取有機(jī)物，合并有機(jī)相，分別以飽和NaHCO3溶液和飽和食鹽水洗滌，無水Na2SO4干燥，過濾，減壓除去乙醚，得棕色黏稠物105 g。

向燒瓶中加入苯300 mL，于80℃加熱溶解后自然冷卻至室溫，析出固體，過濾，濾餅以苯洗滌2～3次，得到類白色固體58 g，再用苯重結(jié)晶，干燥后得白色固體52 g，經(jīng)TLC檢測(cè)為單一斑點(diǎn)，展開劑為乙酸乙酯-石油醚(3∶1)，Rf值為 0.49;mp(熔點(diǎn))87～88℃，即豬去氧膽酸甲酯-苯加合物，收率41%。

在100 mL燒瓶中加入豬去氧膽酸甲酯-苯加合物50 g，NaOH 5 g，乙醇 100 mL 和水 10 mL，于 80℃攪拌回流反應(yīng)5 h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完畢后，減壓回收溶劑至干，得淡黃色固體，加水150 mL，攪拌下用10%鹽酸溶液調(diào)pH至1～2，析出固體，繼續(xù)在常溫下攪拌0.5 h，過濾，濾餅用水洗滌至中性，于50℃真空干燥6～8 h，得到淡黃色固體37.2 g，純度為95.6%。以乙酸乙酯重結(jié)晶，得豬去氧膽酸35.4 g，mp 201 ～202 ℃，純度99.1%，總收率36.8%，氣相色譜(GC)分析未檢測(cè)出苯。1HNMR:δ11.96(s，1H，

)，4.42(d，J=4.4Hz，1H，3-OH)，4.21(d，J=4.0Hz，6-OH)，3.82(m，1H，6-CH)，3.29(m，1H，3-CH)，2.25(m，1H，23-CH)，2.08(m，1H，23-CH)，1.92(m，1H，12-CH)，1.86 ～1.72(m，2H，2-CH，4-CH)，1.72 ～1.76(m，2H，1-CH，22-CH)，1.22～1.58(m，9H)，0.87 ～1.22(m，10H)，0.86(d，J=6.4Hz，3H，21-CH3)，0.84(s，3H，19-CH3)，0.60(s，3H，18-CH3).=+8.2°(c=1，甲醇);MS:393.311 3(M+H+，理論值 393.299 9)。

2.2 豬膽酸的提取和純化

將2.1項(xiàng)下的濾液、洗液以及重結(jié)晶母液合并，減壓回收苯至盡，得到棕色黏稠狀物65 g。加入乙酸酐150 mL，乙酸鈉15 g，于110℃回流5 h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完成后，減壓蒸除約2/3體積的乙酸酐，待降至室溫后加水50 mL以溶解其中的無機(jī)鹽，用乙醚分次提取有機(jī)物，合并有機(jī)相，先用1%NaOH溶液洗滌有機(jī)相至接近中性，再用飽和NaHCO3溶液和飽和食鹽水洗滌，無水Na2SO4干燥，過濾，回收乙醚，得棕黑色黏稠狀物76 g。向燒瓶中加入正己烷250 mL，體系升溫至65℃攪拌使其完全溶解后停止加熱，自然降至室溫，在室溫下攪拌2 h，過濾，濾餅用正己烷洗滌3次，干燥后得到棕色粉末17 g，依次以甲醇及苯-石油醚重結(jié)晶，得白色粉末8.2 g，mp 184～186℃(文獻(xiàn)值181～183 ℃［1］)，為豬膽酸甲酯三醋酸酯。

取250 mL圓底燒瓶，依次加入豬膽酸甲酯三醋酸酯8 g(14.6 mmol)，NaOH 5 g(125 mmol)，乙醇50 mL，水5 mL，于80℃回流反應(yīng)6 h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完畢后，減壓回收溶劑，得灰白色固體，加水10 mL，劇烈攪拌下用10%鹽酸調(diào)節(jié)而至pH 1～2，過濾，濾餅用5%鹽酸洗滌一次，再用水洗滌至中性，干燥后得到淺黃色固體5.5 g。用乙酸乙酯重結(jié)晶，干燥至恒重，得白色粉末5.1 g，TLC檢測(cè)為單一斑點(diǎn)，展開劑為乙酸乙酯-石油醚-乙酸(5∶5∶1)，Rf值為0.28;mp 185～186 ℃(文獻(xiàn)值183～184 ℃［1］］，即為豬膽酸，總收率為 5.1%。1HNMR:δ11.96(s，1H，COOH)，4.33(d，J=4.4 Hz，1H，3-OH)，4.20(d，J=5.6 Hz，1H，6-OH)，3.90(s，1H，7-OH)，3.57(brs，2H，6-CH，7-CH)，3.11(brs，1H，3-CH)，2.08～2.33(m，2H，23-CH3)，1.80 ～ 1.92(m，1H，12-CH)，1.56 ～1.72(m，7H)，0.96 ～ 1.50(m，14H)，0.88(d，J=6.4 Hz，21-CH3)，0.83(s，3H，19-CH3)，0.60(s，3H，18-CH3)。MS:409.298 5(M+H+，理論值為 409.294 9)，431.281 7(M+Na+，理論值)。［α］D(c=1.7，甲醇)，Combined Chemical Dictionary(CCD)中=+5.5°(c=1.7，甲醇)。

2.3 鵝去氧膽酸的提取與純化

將提取完豬膽酸甲酯三醋酸酯的母液與重結(jié)晶母液合并，回收溶劑，得到棕褐色黏稠狀物56 g，此時(shí)其主要成分為鵝去氧膽酸甲酯二醋酸酯。加入乙醇100 mL，升溫至65℃待黏稠物全部溶解后停止加熱，體系自然降至室溫后于冰箱中靜置72 h，析出黃色固體，過濾，濾餅用冰冷甲醇洗滌，干燥后得淡黃色粉末23 g。用甲醇重結(jié)晶，得白色粉末18.6 g，TLC檢測(cè)為單一斑點(diǎn)，展開劑為乙酸乙酯-石油醚(3∶1)，Rf=0.56;mp 115 ～116 ℃(文獻(xiàn)值 112 ～113℃［7］)，為鵝去氧膽酸甲酯二醋酸酯。

取250 mL圓底燒瓶，依次加入鵝去氧膽酸甲酯二醋酸酯 18 g(36.7 mmol)，NaOH 5 g(125 mmol)，乙醇100 mL，水10 mL，于80℃回流5 h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完畢后，減壓回收溶劑，得灰白色固體，加水20 mL，劇烈攪拌下用10%鹽酸溶液調(diào)pH至1～2，析出固體，繼續(xù)于常溫下攪拌0.5 h，過濾，濾餅依次用5%鹽酸和水洗滌，減壓干燥后得到白色固體13.1 g。用丙酮－水重結(jié)晶，干燥至恒重后得白色粉末12.6 g，TLC檢測(cè)為單一斑點(diǎn)，展開劑為乙酸乙酯-石油醚-乙酸(5∶5∶1)，Rf=0.41;mp 144 ～146 ℃(文獻(xiàn)值143 ～144 ℃［7］)，總收率 15%。=+10.2°(c=1，甲醇)［CCD 中= +11°(乙醇)］。1HNMR:δ11.97(s，1H，24-COOH)，4.33(d，J=4.4Hz，1H，3-OH)，4.13(d，J=3.2Hz，7-OH)，3.62(m，1H，7-CH)，3.18(m，1H，3-CH)，2.23 ～2.18(m，1H，23-CH)，2.12 ～ 2.10(m，1H，23-CH)，1.91(m，1H，12-CH)，1.82 ～ 1.66(m，6H)，1.48 ～1.35(m，6H)，1.27 ～1.14(m，7H)，1.11 ～1.06(m，4H)，0.86(d，J=6.8Hz，3H，21-CH3)，0.84(s，3H，19-CH3)，0.60(s，3H，18-CH3)。

3 結(jié)果與討論

3.1 酸催化劑的種類及用量對(duì)甲酯化反應(yīng)的影響

甲酯化反應(yīng)中酸催化劑的使用對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較大。因此選擇對(duì)甲苯磺酸、磷酸和硫酸對(duì)酯化反應(yīng)進(jìn)行了考察，反應(yīng)條件為常溫下攪拌24 h。

發(fā)現(xiàn)三種酸均可催化該反應(yīng)，但硫酸在常溫下即可較好的催化該反應(yīng)，當(dāng)投料比為1∶0.5時(shí)，室溫24 h即可完成反應(yīng)，因此，選用硫酸作為酸催化劑，確定原料與硫酸的投料比為1∶0.5。

3.2 豬膽酸酯的提取溶劑對(duì)產(chǎn)物影響

由于用乙酸酐酯化后的產(chǎn)物為棕色黏稠物，不易分離，要選取一個(gè)適宜的提取溶劑來提取豬膽酸酯。取同批次的棕色黏稠物各5 g，考察了正戊烷，正己烷以及石油醚的提取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)正己烷作為提取溶劑時(shí)收率最高，因此本研究選取正己烷作為提取豬膽酸酯的溶劑。

3.3 重結(jié)晶溶劑對(duì)豬膽酸酯收率的影響

由正己烷提取出的豬膽酸甲酯三醋酸酯干燥后為淡棕色固體，用甲醇重結(jié)晶后得到類白色固體，再用溶劑進(jìn)行二次重結(jié)晶，考察了苯、苯-石油醚作為重結(jié)晶溶劑對(duì)產(chǎn)品收率的影響，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用苯作為重結(jié)晶溶劑時(shí)，收率僅為52%，而使用苯-石油醚重結(jié)晶時(shí)收率達(dá)到86.2%，而且得到的產(chǎn)品純度經(jīng)高效液相色譜(HPLC)分析，含量大于98%，因此選用苯-石油醚作為此步的重結(jié)晶試劑。

3.4 提取溶劑及時(shí)間對(duì)鵝去氧膽酸酯收率的影響

得到除去溶劑后的棕褐色黏稠物后，取等量的棕色黏稠物各5 g，考察了甲醇和乙醇作為鵝去氧膽酸酯的提取溶劑，以及提取時(shí)間對(duì)產(chǎn)品的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙醇對(duì)鵝去氧膽酸甲酯二醋酸酯的提取效率明顯高于甲醇，而且隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，提取效率也在緩慢提高，但在72 h后已經(jīng)不再有明顯變化，故本研究選取乙醇作為鵝去氧膽酸甲酯醋酸酯的提取溶劑，并確定提取時(shí)間為72 h。

3.5 重結(jié)晶溶劑對(duì)鵝去氧膽酸甲酯乙酸酯收率的影響

用甲醇重結(jié)晶時(shí)溶劑量雖然較大，但有利于攪拌和產(chǎn)物從容器中取出，產(chǎn)品損失量稍大;用乙醇重結(jié)晶時(shí)，用量少，收率稍高，但產(chǎn)物的攪拌和從容器中取出困難。因此選用甲醇作為鵝去氧膽酸甲酯二醋酸酯的重結(jié)晶溶劑。

此外，分離出的三種膽酸的紅外光譜均與標(biāo)準(zhǔn)紅外光譜一致。

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The extraction and purification of three kinds of bile acids from pig bile

DENG Qi-hua1，YAO Ying2，LIU Ting2，JING Ling-ling2，LI Zi-cheng2
(1.Department of Pharmaceutical and Environmental Engineering，Sichuan Chemical Vocation Technology College，Luzhou 646005，China;2.School of Chemical Engineering，Sichuan University，Chengdu 610065，China)

Purpose To prepare three bile acids from the mixed pig bile acids.Methods The mixed pig bile acids were first methyl-esterified then methyl hyodeoxycholanate was separated and recrystallized from benzene because of the insolubility of methyl hyodeoxycholanate-benzene complex in benzene，The mother liquor was distilled and then acetic acid anhydride was added to make all the hydroxyl of bile acid methyl esters transforming to acetate ester.Methyl hyocholanate triacetate was separated in hexane，methyl chenodeoxycholanate diacetate was precipitated from ethanol，and purified by recrystallization from methanol.After hydrolyzing of the three kinds of separated bile acid methyl esters，three individual components whose purities were higher than 98%were obtained.Results By this extraction process could be isolated pure hyodeoxycholic acid，hyocholic acid and chenodeoxycholic acid at one time with short steps，simplified method and less solvent.Conclusion The route，which could not only make the best recycle of raw material，but also reduce environmental pollution，is applicable to the industrial production.

hyodeoxycholic acid;hyocholic acid;hyodeoxycholic acid;extraction;purification

TQ464.5

A

1005-1678(2012)04-0405-03

2011-07-02

鄧啟華，男，副教授，主要從事藥物中間體及藥物合成;李子成，男，通信作者，副教授，Tel:13678019184，E-mail:sculzc@scu.edu.cn。