自體造血干細(xì)胞移植與1型糖尿病

景華

1型糖尿病是由自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞介導(dǎo),針對胰腺內(nèi)分泌β細(xì)胞的器官特異性的自身免疫性疾病[1]。幾乎所有1型糖尿病患者都需要應(yīng)用外源性胰島素注射來控制血糖，患者不但遭受胰島素注射所帶來的不便和痛苦，又不能完全控制血糖穩(wěn)定并避免遠(yuǎn)期并發(fā)癥的發(fā)生。胰島細(xì)胞移植為解決上述難題提供了新途徑[2-3]，但是由于胰腺供體不足及移植排斥等原因，限制了胰島細(xì)胞移植的廣泛開展[4]。造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cell,HSC)是所有的免疫細(xì)胞(包括T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞)的祖細(xì)胞，具有極高的自我更新、多向分化和重建造血的潛能，CD34抗原是HSC標(biāo)志性抗原，CD34+細(xì)胞（表達(dá)CD34抗原的細(xì)胞）是非均質(zhì)性的細(xì)胞群，其中既含有HSC也存在不同分化階段的各系造血祖細(xì)胞，并隨著造血細(xì)胞逐漸成熟，CD34+的表達(dá)量逐漸減少，直至消失。正常人骨髓低密度單個核細(xì)胞中CD34+細(xì)胞約占1.5﹪（1.0﹪～ 3.0﹪），臍帶血為 0.2﹪～0.5﹪，外周血 CD34+細(xì)胞約為骨髓的1/10，CD34+細(xì)胞群被血液學(xué)家稱為最佳的移植物。根據(jù)以上3種不同的HSC來源，相應(yīng)的在臨床上被稱為骨髓HSC移植、外周血HSC移植和臍帶血HSC移植。下面將HSC移植治療1型糖尿病從基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用進(jìn)行綜述。

一、基礎(chǔ)研究

干細(xì)胞具有多向分化的潛能，特定微環(huán)境控制著干細(xì)胞的更新和分化。隨著對干細(xì)胞的研究的深入，發(fā)現(xiàn)其不僅可以分化為同一胚層來源的細(xì)胞，而且可以分化為不同胚層來源的細(xì)胞，即干細(xì)胞具有可塑性。隨著HSC研究的興起,作為一類具有多向分化潛能的細(xì)胞,已經(jīng)逐漸成為人們尋找胰島β細(xì)胞替代物的新資源[5]。

（一）HSC向胰島β細(xì)胞分化

Oh等[6]研究表明骨髓細(xì)胞體外培養(yǎng)可以誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞，經(jīng)擴(kuò)增后移植可以糾正糖尿病鼠的高血糖，效果可以持續(xù)90 d。Tang等[7]將鼠骨髓源HSC在煙堿和exendin環(huán)境下培養(yǎng)1周,用抗胰島素和抗C肽抗體標(biāo)記,發(fā)現(xiàn)10﹪～ 20﹪的骨髓源HSC標(biāo)記抗胰島素抗體和C肽抗體,說明骨髓HSC真正合成和分泌了胰島素和C肽。Lanus等[8]認(rèn)為骨髓源HSC可以分化為有活性的胰島β細(xì)胞,他建立了一個小鼠模型，將標(biāo)記有熒光蛋白的骨髓干細(xì)胞移植到小鼠的胰腺。行骨髓移植后大約1～2個月的受體小鼠的胰島內(nèi)發(fā)現(xiàn)了骨髓來源的胰島細(xì)胞。這些細(xì)胞表達(dá)胰腺β細(xì)胞所特有的遺傳標(biāo)志物，并檢測到受體母鼠體內(nèi)來自于雄性供體小鼠的熒光細(xì)胞的Y染色體呈陽性。當(dāng)給予生理性葡萄糖刺激時，骨髓來源細(xì)胞分泌胰島素，并重現(xiàn)了胰島β細(xì)胞鈣離子的細(xì)胞內(nèi)流。

Hess等[9]建立了一個鏈脲霉素致糖尿病的小鼠模型，鏈脲霉素致糖尿病小鼠給予致死劑量的放射線照射，再移植入標(biāo)記有綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的供體骨髓細(xì)胞。行骨髓移植17 d后的小鼠血糖正常，有正常的胰島素分泌，42 d生存率達(dá)75﹪～ 85﹪；而對照組小鼠持續(xù)高血糖，且死亡率增加，42 d生存率僅為0﹪～ 50﹪。試驗小鼠表現(xiàn)出伴隨血糖升高胰島素分泌增強的現(xiàn)象。在隨后的試驗步驟中，研究者通過檢測著色的血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1（Plateletendothelial Cell Adhesion Molecule，PECAM-1）內(nèi)皮細(xì)胞蛋白，發(fā)現(xiàn)骨髓來源細(xì)胞在胰腺中已分化成為內(nèi)皮細(xì)胞。Wang等[10]將GFP轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓細(xì)胞給新生期非肥胖性糖尿?。╪on-obese diabetic，NOD）小鼠,2個月后發(fā)現(xiàn)NOD小鼠40﹪的胰腺導(dǎo)管細(xì)胞起源于供者骨髓細(xì)胞,并在胰腺中發(fā)現(xiàn)了表達(dá)GFP的胰島細(xì)胞。綜合以上試驗認(rèn)為骨髓細(xì)胞進(jìn)入已被破壞的胰島內(nèi)并分化成為內(nèi)皮細(xì)胞，并刺激胰腺前體細(xì)胞增殖，使這些前體細(xì)胞最終分化成為胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞。

骨髓干細(xì)胞主要通過直接的轉(zhuǎn)分化和間接分化、移植誘導(dǎo)微嵌合狀態(tài)，形成免疫耐受、細(xì)胞融合以及參與細(xì)胞的修復(fù)和再生等方式治療糖尿病患者。轉(zhuǎn)分化是一種定向分化細(xì)胞改變基因表達(dá)模式而轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N完全不同的細(xì)胞類型，而骨髓干細(xì)胞可直接轉(zhuǎn)分化為胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞[11]。Steptoe等[12]通過將骨髓細(xì)胞或HSC移植到NOD小鼠，發(fā)現(xiàn)骨髓移植能夠誘導(dǎo)糖尿病鼠的耐受，減輕胰島細(xì)胞的免疫損傷，防止糖尿病發(fā)展。

（二）HSC促進(jìn)內(nèi)源性胰島β細(xì)胞的修復(fù)與再生

研究表明，骨髓移植后，可以參與成體組織的再生，如神經(jīng)細(xì)胞、腎臟、肌肉、肝臟、皮膚、胰腺、小腸及結(jié)腸，骨髓中的循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞參與成體的血管形成，包括生理更新和損傷修復(fù)[13]。Kojima等[14]研究表明糖尿病鼠胰腺外許多組織含有胰島素表達(dá)陽性細(xì)胞，包括胸腺、骨髓、脂肪組織、脾臟和肝臟，這些胰島素表達(dá)陽性細(xì)胞來源于骨髓。Mathews等[11]研究則表明骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞可遷移至小鼠受損傷的胰島處，這些細(xì)胞具有促血管形成作用，參與胰島β細(xì)胞的再生。Burt等[15]研究表明對于糖尿病患者來說，僅輸入足夠數(shù)量的胰島細(xì)胞并不能達(dá)到治療效果，胰腺中胰島β細(xì)胞仍會遭到自身免疫系統(tǒng)的攻擊而破壞，導(dǎo)致胰島病的產(chǎn)生，而來源于骨髓的HSC具有可以誘導(dǎo)對自身抗原的免疫耐受及胰島細(xì)胞再生的雙重功能，這一研究也說明HSC能夠誘導(dǎo)免疫耐受，調(diào)節(jié)T細(xì)胞的陽性選擇及陰性選擇，改善糖尿病實驗對象的免疫功能，促進(jìn)胰島細(xì)胞再生。Rachdi等[16]研究表明小鼠?胰島中有10﹪～ 20﹪的胰島素陽性細(xì)胞可以檢測出HSC的KIT標(biāo)志物，而且，研究顯示表達(dá)c-kit干細(xì)胞標(biāo)志物（可作為干細(xì)胞表面標(biāo)志物）的骨髓細(xì)胞可使高血糖水平降低，而c-kit表達(dá)陰性的細(xì)胞卻無此功能。說明HSC參與胰島細(xì)胞的再生。Banerjee等[17]認(rèn)為骨髓HSC移植有助于胰島再生。Hasegawa等[18]在實驗中發(fā)現(xiàn)在新生胰島周圍有較多的CD45+細(xì)胞，認(rèn)為糖尿病小鼠骨髓移植后，骨髓細(xì)胞首先歸巢，隨后被動員到受損胰腺組織，進(jìn)而促進(jìn)胰島細(xì)胞的再生。Gao等[19]發(fā)現(xiàn)骨髓移植可以促使糖尿病小鼠胰島及胰管再生，特別是CD34+細(xì)胞促進(jìn)胰島組織的修復(fù)及再生。

二、臨床研究

目前糖尿病的治療臨床上主要用胰島素替代治療和血糖控制，并沒有徹底的根治方案，而HSC能夠誘導(dǎo)出成熟的胰島β細(xì)胞，分化出胰島結(jié)構(gòu)，同時又避免特異的免疫反應(yīng)則可以達(dá)到臨床的治愈，解決糖尿病患者的痛苦。骨髓HSC移植和外周血HSC移植是臨床常用的方法，由于外周血干細(xì)胞采集簡單、方便、安全和有效，且外周血HSC與骨髓移植相比，造血和免疫恢復(fù)快，因而可以減少住院日，減少抗生素的使用和輸血依賴，降低醫(yī)療費用，所以在臨床上的應(yīng)用越來越廣泛。

（一）國外研究

Voltarelli等[20]研究報道，采用大劑量免疫抑制劑后進(jìn)行自體非清髓性HSC移植治療15例新診斷1型糖尿病患者。具體方法：采用環(huán)磷酰胺抑制淋巴細(xì)胞同時聯(lián)合集落刺激因子動員骨髓后，自外周血采集自體HSC，再予大劑量環(huán)磷酰胺聯(lián)合抗淋巴細(xì)胞球蛋白預(yù)處理，最后將采集的自體HSC靜脈回輸。結(jié)果在7～36個月的隨訪中，14例患者可達(dá)到并維持不同時間的胰島素非依賴，這是首例高劑量免疫抑制聯(lián)合自體HSC移植治療人類1型糖尿病的報告。該研究小組后來增加8名病人，結(jié)果：在7～58個月的隨訪時間（平均29.8個月，中位數(shù)，30個月），20例沒有酮癥酸中毒患者脫離胰島素[21]。其中12例保持了平均31個月，（范圍14～52個月），8例復(fù)發(fā)，并恢復(fù)使用低劑量胰島素（0.1～0.3 IU/kg）。在連續(xù)脫離胰島素的病人，糖化血紅蛋白水平低于7.0﹪，平均的C肽曲線下面積大幅上升，取得了良好的血糖控制大多數(shù)患者脫離胰島素。

（二）國內(nèi)研究

早在2004年張傳倉等[22]即用環(huán)磷酰胺及粒細(xì)胞集落刺激因子動員的方法動員骨髓干細(xì)胞到外周血中，修復(fù)損傷的胰腺β細(xì)胞，結(jié)果該患者胰島素需用量減少64﹪，空腹C肽水平恢復(fù)正常?？赡芘c大劑量環(huán)磷酰胺免疫抑制與外周血HSC遷徙到胰腺組織中，在胰腺組織微環(huán)境的誘導(dǎo)下分化增殖為胰腺β細(xì)胞有關(guān)。沈山梅等[23]采用自體非清髓性HSC移植治療1型糖尿病1例，該患者移植后第27天停止注射胰島素，隨診15個月，病情穩(wěn)定，血糖控制良好，糖化血紅蛋白穩(wěn)定于7.0﹪以下。初步顯示出一定的臨床有效性。景華等[24]報道，采用T淋巴系統(tǒng)清除和自體HSC免疫重建治療1型糖尿病2例，具體方法：單用粒細(xì)胞集落刺激因子動員、采集，環(huán)孢素A及ATG預(yù)處理后，回輸自體HSC。結(jié)果2例患兒分別于回輸后第14，22天停用胰島素，復(fù)查糖化血紅蛋白及C肽恢復(fù)正常，谷氨酸脫羧酶抗體滴度明顯降低。到目前停用胰島素分別為18個月、16個月。初步顯示自體非清髓性HSC移植治療1型糖尿病的臨床有效性，仍需大樣本量前瞻性研究，以進(jìn)一步評估此療法的遠(yuǎn)期療效與安全性。

（三）作用機(jī)制

自體HSC移植治療1型糖尿病的作用機(jī)制尚不清楚?？赡芘c以下機(jī)制有關(guān)：（1）免疫抑制可抑制自身免疫反應(yīng)，阻止胰島炎性反應(yīng)的破壞作用；（2）免疫抑制可誘導(dǎo)移植免疫耐受，阻止自身反應(yīng)性糖尿病的發(fā)生；（3）移植的HSC促進(jìn)受體胰島β細(xì)胞再生與修復(fù)[25]。

三、挑戰(zhàn)及展望

1型糖尿病是醫(yī)學(xué)難題,目前沒有根治辦法。HSC是目前研究最廣泛、應(yīng)用最成熟的成體干細(xì)胞，不僅來源豐富，易采集，而且能抑制自身排斥反應(yīng)，擁有廣泛的應(yīng)用前景。其基礎(chǔ)研究證實HSC可定向分化為胰島β細(xì)胞,促進(jìn)內(nèi)源性胰島β細(xì)胞的修復(fù)與再生,臨床研究結(jié)果取得了令人鼓舞的治療效果,為糖尿病患者點燃了新的希望，也為研究人員提供了新的突破口。毋庸置疑，HSC已成為目前治療1型糖尿病的最佳種子細(xì)胞之一，雖然目前存在一些問題，如需解決免疫排斥，以及如何選擇合適的移植方式、時間、部位和數(shù)量等，找到最佳的搭配組合，提高治療效果等等，但隨著HSC及其相關(guān)研究的深入和技術(shù)的提高，相信在未來的數(shù)年內(nèi)，HSC在1型糖尿病中的應(yīng)用將有新的突破。

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