22q11微缺失機(jī)制及臨床應(yīng)用研究進(jìn)展

孫曉燕，王云英，紀(jì)向虹

(山東省青島市市立醫(yī)院，青島 266000)

22q11微缺失綜合征(22q11 microdeletion syndrome，22q11 DS)是由于22號染色體長臂近著絲粒端微片段22q11.21～q11.23缺失引起的遺傳綜合征，也是人類最常見的染色體微缺失綜合征。其活產(chǎn)新生兒發(fā)病率約為 1/8000 ～ 1/4000［1-2］。22q11DS臨床表型復(fù)雜，主要包括DiGeorge綜合征(DiGeorge syndrome，DGS)、腭-心-面綜合征(velocardiofacial syndrome，VCFS)和圓錐動脈干-異常面容綜合征(conotruncal anomaly face syndrome，CAFS)等，上述綜合征均具有共同的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。其22q11微缺失的比例分別為 88%、85%和100%。突出表現(xiàn)為特殊類型的先天性心臟病、低鈣血癥、免疫缺陷、面容異常、腭裂、腭咽功能不全、腎臟畸形、發(fā)音及喂養(yǎng)困難、認(rèn)知、行為及精神異常［3］。盡管22q11DS表型廣泛且多樣，但大多數(shù)患有先天性心臟病(congenital heart disease，CHD)，且他們經(jīng)常合并低鈣血癥、免疫功能低下、后鼻孔堵塞等異常 ，手術(shù)成功率及預(yù)后遠(yuǎn)不如非綜合征型CHD患者，所以產(chǎn)前診斷、二級干預(yù)將成為預(yù)防嚴(yán)重出生缺陷的主要手段［4-5］。

1 發(fā)生機(jī)制

盡管22q11DS有各種各樣的臨床表型，但大多是22號染色體長臂近著絲粒端微片段22q11.21～q11.23缺失所致，典型缺失區(qū)域(typical deletion region，TDR)約 1.5 ～3.0 Mb。一般認(rèn)為可分為 3 種類型，其中大約90%的患者有3 Mb大小的典型缺失區(qū)域，這段區(qū)域內(nèi)包含有30多個(gè)基因。8%的患者有1.5 Mb的小缺失，這段區(qū)域內(nèi)含有24個(gè)基因，另外還有極少數(shù)患者有易位或一些不典型的小片段缺失和遠(yuǎn)端缺失。在典型缺失區(qū)域里，分離出4個(gè)重復(fù)序列及30多個(gè)基因，其中較為熱點(diǎn)的基因有DCGC R-6，DCCRl/TUPLEl/HIRA、GNB1L、TBX1、DVL222、CLATHRIN/CLTCL，UFD1 L(ubiquity fusion degradation-1-like編碼蛋白降解酶1)和pcqap(pc2 glutamine/Q-rich-associatedprotein，編碼多蛋白復(fù)合體PC2的亞單位)等數(shù)個(gè)關(guān)鍵基因［6］。

2 臨床表現(xiàn)

22q11DS的復(fù)雜性有一部分原因是其擁有繁多的各系統(tǒng)的缺陷，已有超過180種臨床表現(xiàn)被報(bào)道描述，主要涉及心臟、頜面、血管、中樞神經(jīng)、免疫系統(tǒng)及甲狀旁腺發(fā)育不良引起的低鈣血癥等。

2.1 心臟畸形 22q11DS患者約80%患有先天性心臟畸形，最典型的為心臟圓錐干畸形(CTD)，包括法洛四聯(lián)征(TOF)、主動脈弓離斷(IAA，多數(shù)是B型)、永存動脈干(PTA)、肺動脈閉鎖(PS)、室間隔缺損(VSD)、大動脈異位(TGA)及右室雙流出道(DORV)等。各類心臟畸形在22q11DS中發(fā)生率并不相同，其中法洛四聯(lián)征占20% ～30%，主動脈弓異常占 l5%，永存動脈干占10%，室間隔缺損占15%，其他畸形占5% ～10%。22q11DS所涉及的CHD表型并不特異，而是多種多樣的，也就是說幾乎所有CHD類型的患者都有可能存在22q11微缺失。

其中Marino等［7］認(rèn)為22q11DS中的先天性心臟病類型以永存動脈干A3型最多見，動脈干從右室發(fā)出，常與IAA伴發(fā)。永存動脈干是一種罕見的CHD，而在22q11DS中則是常見類型。這點(diǎn)也可以進(jìn)一步提示PTA患兒應(yīng)當(dāng)高度警惕患有22q11DS。

2.2 頜面畸形 腭裂是VCFS的主要表現(xiàn)之一，70%22q11DS患者中可見腭帆發(fā)育不全［8］，也是導(dǎo)致語言障礙、喂養(yǎng)困難的重要原因。常見的顱面部畸形有:雙眼距離過遠(yuǎn)、瞼裂過短、眼下斜、小眼;鼻梁低凹、鼻根寬、鼻翼發(fā)育不良、鼻頭突出、鼻道狹窄、鼻尖突呈燈泡樣、鼻音重;小嘴、唇薄、人中長、硬腭高拱、腭咽發(fā)育不良、黏膜下腭裂、懸雍垂分裂、口角肌肉下壓、魚尖樣嘴;小耳葉、耳廓反轉(zhuǎn)、疊耳、方形耳廓、無耳垂、耳位低、小頜及非對稱性哭型面容等。喂養(yǎng)困難是22q11DS常見癥狀之一，可表現(xiàn)為鼻反流、嘔吐、窒息、喂養(yǎng)延長、吸-咽-呼吸同步。面部特征在幼兒患者中比較明顯，兒童測量評價(jià)較之成人更有意義。但是臨床中典型特殊面容少見，又與其他綜合征的特殊面容有重疊，不容易被臨床醫(yī)師發(fā)現(xiàn)及鑒別，故單純從特殊面容人手很難篩查22q11DS病例，易造成漏診、誤診和混淆，缺乏可行性。

2.3 免疫缺陷 超過50%的22q11DS(特別是DGS)病人常伴細(xì)胞性免疫缺陷，其中僅不足5% 的22q11DS患者能夠自身獲得免疫，產(chǎn)生免疫抗體。免疫缺陷病表現(xiàn)為T細(xì)胞數(shù)量減少，胸腺體積變小。外周血80%的淋巴細(xì)胞為T細(xì)胞，故淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)能較好反映外周血T細(xì)胞水平。嚴(yán)重免疫缺陷者可有淋巴細(xì)胞減少或明顯減少。也有部分患者T細(xì)胞數(shù)量正常，但其功能不一定正常，可進(jìn)一步行淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率等T細(xì)胞功能分析，以發(fā)現(xiàn)輕型患兒。兒童隨著年齡增大，T細(xì)胞數(shù)量增加，感染減少［9］;但也存在胸腺萎縮，T細(xì)胞缺如的現(xiàn)象。但是胸腺體積與T細(xì)胞數(shù)量、T細(xì)胞功能及免疫功能是否存在關(guān)聯(lián)，能否反映22q11DS的免疫狀態(tài)，胸腺體積能否作為診斷依據(jù)和常規(guī)檢查方法還有待研究。因患者免疫功能與胸腺大小、缺失片段長短現(xiàn)暫無明確關(guān)聯(lián)［10］，所以建議對22q11DS病人均行免疫功能檢測。22q11DS除常見細(xì)胞免疫缺陷外，還可出現(xiàn)體液免疫缺陷。

2.4 發(fā)育、行為和精神障礙 22q11DS患者約40%～46%存在認(rèn)知功能障礙和行為障礙，體現(xiàn)在運(yùn)動、認(rèn)知、語言等方面，特別在抽象邏輯、數(shù)學(xué)運(yùn)算及視覺空間記憶上更明顯。家族性22q11DS患者智能障礙發(fā)生率要比新發(fā)病例高。可表現(xiàn)為:智能低下和語言功能障礙，注意力不集中、學(xué)習(xí)認(rèn)知障礙、雙相性精神異常和暴躁，妄想癥，自閉癥，老年癡呆癥及焦慮、抑郁、強(qiáng)迫等精神異常。20% ～30%的22q11DS患者在成年人階段會發(fā)展成精神分裂癥。這個(gè)患病率相當(dāng)于正常人群25倍多。22q11DS患者行為障礙包括注意缺陷多動障礙(ADHD)、自閉癥障礙、社會能力缺失、沖動行為和情感淡漠等［11］。其中自閉癥障礙癥候群(ASDS)患病率較高，可以看作是22q11DS中典型的行為障礙表現(xiàn)。輕度的認(rèn)知智力缺陷在22q11DS患者中也很常見，多項(xiàng)研究表明22q11DS患兒的言語能力優(yōu)于操作能力，其平均 IQ 值均較低，約在 50 ～100［12］。

2.5 內(nèi)分泌異常 大約70%的22q11DS患者在新生兒期會因甲狀旁腺發(fā)育不良可導(dǎo)致低鈣血癥，主要表現(xiàn)為低鈣性抽搐、堿性磷酸酶升高、血清中甲狀旁腺素低。新生兒期重度低鈣血癥以后可以自然緩解，也可再次復(fù)發(fā);而隱性低甲狀旁腺激素血癥也可能轉(zhuǎn)變?yōu)榈外}性低甲狀旁腺激素血癥。此外，22q11DS患者還可表現(xiàn)為生長遲緩，其中部分存在生長激素缺乏。

3 22q11DS診斷

3.1 染色體核型分析 染色體核型分析是根據(jù)染色體的長度、著絲點(diǎn)位置、臂比、隨體的有無等特征，并借助染色體分帶技術(shù)對某一生物的染色體進(jìn)行分析、比較、排序、編號。其分析以體細(xì)胞分裂中期染色體為研究對象。染色體核型分析包括普通帶型分析(350～550條帶)和高分辨技術(shù)(750～850條帶)。普通帶型分析可將一套單倍體染色體顯示350～550條帶紋，可以從整體上觀察染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目異常，但不能檢出亞帶缺失，所以不適合22q11DS的篩查。高分辨顯帶染色體分析顯示750～850條帶紋，可以協(xié)助分子遺傳學(xué)及基因定位。但有報(bào)道顯示即使是采用高分辨顯帶染色體分析技術(shù)，也只能檢測10% ～20%的22q11DS。盡管其很難檢測出22q11DS，但因它能排除有無其他染色體異常(如2三體)，且技術(shù)成熟、操作簡單、費(fèi)用經(jīng)濟(jì)，因而可作為一種初篩手段。

3.2 熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH) 用特定熒光如生物素取代同位素標(biāo)記DNA制備探針，與靶DNA進(jìn)行原位雜交，通過免疫細(xì)胞化學(xué)過程連接上熒光素標(biāo)記物，使雜交信號以熒光顯示，在熒光顯微鏡下觀察探針標(biāo)記或位點(diǎn)的技術(shù)，如有結(jié)合位點(diǎn)缺失 ，則熒光缺失。此方法既有分子雜交的高度特異性和敏感性，又能在染色體原位顯色，因而定位準(zhǔn)確，結(jié)果穩(wěn)定，且檢測結(jié)果直觀，所需標(biāo)本少，已成為當(dāng)前22q11DS檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。目前主要采用的商業(yè)探針有TUPLE1探針和N25探針，但這些探針主要分布22q11LCRA、LCRB區(qū)域，對不經(jīng)過探針位點(diǎn)的遠(yuǎn)端缺失和小片段缺失缺乏檢測能力。

3.3 多重PCR 一般PCR僅應(yīng)用一對引物，通過PCR擴(kuò)增產(chǎn)生一個(gè)核酸片段，主要用于單一致病因子等的鑒定。多重PCR(multiplex PCR)，又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR，它是在同一PCR反應(yīng)體系里加上二對以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng)，其反應(yīng)原理，反應(yīng)試劑和操作過程與一般PCR相同。是檢測22q11DS的方便、低成本、時(shí)間短且可靠的技術(shù)。但是，該方法必須要有父母的DNA樣品做對照才能出結(jié)果，而且對純合子擴(kuò)增產(chǎn)物為單一條帶者，不能判別是否存在22q11DS。

3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitativ PCR，F(xiàn)Q-PCR) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，由于熒光信號強(qiáng)弱對應(yīng)DNA擴(kuò)增的量，從而可以計(jì)算出初始模板DNA的含量，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、擁有自動化程度高等特點(diǎn)。但它的應(yīng)用仍有一定的局限性，如不能檢測出染色體平衡易位和嵌合。

3.5 比較基因組雜交(comparative genomic hybridization，CGH) 比較基因組雜交是自1992年后發(fā)展起來的一種分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，它通過單一的一次雜交可對某組織整個(gè)基因組的染色體拷貝數(shù)量的變化進(jìn)行檢查。是一種全方位檢測法，可以快速、系統(tǒng)檢測整個(gè)基因組內(nèi)染色體的增加與丟失。其基本原理是用不同的熒光染料通過缺口平移法分別標(biāo)記腫瘤組織和正常細(xì)胞或組織的DNA制成探針，并與正常人的間期染色體進(jìn)行共雜交，以在染色體上顯示的腫瘤與正常對照的熒光強(qiáng)度的不同來反映整個(gè)腫瘤基因組DNA表達(dá)狀況的變化，再借助于圖像分析技術(shù)可對染色體拷貝數(shù)量的變化進(jìn)行定量研究。CGH技術(shù)的優(yōu)點(diǎn):①實(shí)驗(yàn)所需DNA樣本量較少，做單一的一次雜交即可檢查待檢測樣本的整個(gè)基因組的染色體拷貝數(shù)量的變化。②此法不僅適用于外周血、培養(yǎng)細(xì)胞和新鮮組織樣本的研究，還可用于對存檔組織的研究，也可用于因DNA量過少而經(jīng)PCR擴(kuò)增的樣本的研究。CGH技術(shù)的局限性:CGH技術(shù)所能檢測到的最小的DNA擴(kuò)增或丟失是在3-5Mb，故對于低水平的DNA擴(kuò)增和小片段的丟失會漏檢。此外在相差染色體的拷貝數(shù)量無變化時(shí)，CGH技術(shù)不能檢測出平等染色體的易位(就是姐妹染色單體同源序列的互換)。用cDNA微陣列代替中期染色體后，其分辨率大大提高 ，產(chǎn)生了微陣列比較基因組雜交技術(shù)(array-based CGH)，不需要染色體核型，能檢測到的最小的DNA擴(kuò)增或丟失是在25kb［13］。

3.6 多重連接探針擴(kuò)增 (multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)MLPA是2002年由荷蘭的Schouten等［14］建立的一種靈敏度極高的相對定量技術(shù)?；驹戆ㄌ结樅桶行蛄蠨NA進(jìn)行雜交，之后通過連接、PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物通過毛細(xì)管電泳分離及數(shù)據(jù)收集，分析軟件對收集的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析最后得出結(jié)論。每個(gè)MLPA探針包括兩個(gè)熒光標(biāo)記的寡核苷酸片段，一個(gè)由化學(xué)合成，一個(gè)由M13噬菌體衍生法制備;每個(gè)探針都包括一段引物序列和一段特異性序列。在MLPA反應(yīng)中，兩個(gè)寡核苷酸片段都與靶序列進(jìn)行雜交，之后使用連接酶連接兩部分探針。連接反應(yīng)高度特異，只有當(dāng)兩個(gè)探針與靶序列完全雜交，即靶序列與探針特異性序列完全互補(bǔ)，連接酶才能將兩段探針連接成一條完整的核酸單鏈;反之，如果靶序列與探針序列不完全互補(bǔ)，即使只有一個(gè)堿基的差別，就會導(dǎo)致雜交不完全，使連接反應(yīng)無法進(jìn)行。連接反應(yīng)完成后，用一對通用引物擴(kuò)增連接好的探針，每個(gè)探針的擴(kuò)增產(chǎn)物的長度都是唯一的，范圍在130～480bp。最后，通過毛細(xì)管電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物，Genemarker軟件分析，得出結(jié)論。只有當(dāng)連接反應(yīng)完成，才能進(jìn)行隨后的PCR擴(kuò)增并收集到相應(yīng)探針的擴(kuò)增峰，如果檢測的靶序列發(fā)生點(diǎn)突變或缺失、擴(kuò)增突變，那么相應(yīng)探針的擴(kuò)增峰便會缺失、降低或增加，因此，根據(jù)擴(kuò)增峰的改變就可判斷靶序列是否有拷貝數(shù)的異常或點(diǎn)突變存在。在有明確篩選方向時(shí)，如對 CHD患者篩選有無22q11微缺失，HD-MLPA是性價(jià)比最高的方法，因它能檢測出經(jīng)典 FISH探針以外的不典型缺失或擴(kuò)增，且有快速、價(jià)廉、自動化等特點(diǎn)，不久有取代FISH的可能。由此可見，MLPA尤其是HDMLPA技術(shù)在較大基因多位點(diǎn)的定量研究中有著廣泛的應(yīng)用前景。

4 展望

22q11DS是最普遍的遺傳綜合征之一，但臨床表型極其多樣性，尚無現(xiàn)成的診斷指南。但如能從其常見、早見的CHD表型入手、采用合理的方法進(jìn)行22q11微缺失檢測，能夠早發(fā)現(xiàn)先天性心臟病合并癥，做好圍手術(shù)期護(hù)理，預(yù)防感染，減少并發(fā)癥，降低病死率提即可提高該類患者的生存期及生存質(zhì)量，并為長期動態(tài)隨訪及遺傳咨詢提供依據(jù)。

目前，國內(nèi)外對22q11微缺失的研究主要著眼于出生以后的人群，而在產(chǎn)前診斷方面的報(bào)道鮮見。但從優(yōu)生優(yōu)育和節(jié)約社會資源的角度來看，22q11DS的產(chǎn)前診斷和二級干預(yù)已是當(dāng)務(wù)之急。隨著產(chǎn)前診斷技術(shù)在22q11DS的防治中應(yīng)用日益廣泛，這對優(yōu)生優(yōu)育工作將有重要的意義。

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