熒光原位雜交技術在人染色體異常研究中的應用

宋 杰

前言

熒光原位雜交技術(Fluorescence in situ Hybridization，簡稱FISH)的原理是以核酸堿基互補配對原則為基礎所發(fā)展出來的檢測技術，主要是利用DNA序列的互補性，通過熒光標記的DNA探針與預處理的待測樣本的DNA進行原位雜交，在熒光顯微鏡下，對熒光信號進行辨別和計數(shù)，即可對細胞、組織樣本中的染色體或基因異常進行檢測和診斷。

FISH用于特定核酸序列在不同組織結構中的定位，已經(jīng)有20多年的研究歷史。目前FISH技術應用范圍越來越廣，技術不斷完善改進。盡管FISH技術的基本原理非常簡單，但是高靈敏度的檢測、多個物種間的同時檢測、自動化數(shù)據(jù)獲取和分析等技術都得到了很大的改進和提高。關鍵性檢測環(huán)節(jié)的改進獲得了低背景雜交探針，同時也突破了對多個靶位點進行定位和分析的技術難題。FISH流程的完善和多色FISH的多位點檢測進一步擴大了FISH技術檢測核酸的范圍。FISH技術操作程序的簡化和檢測靈敏度的提高，使得FISH技術從原先的一種次要檢測手段日益轉變成一種首要的生物學核酸檢測技術 。由于技術本身操作簡單、重復性好、具有較高的靈敏性及特異性，因此很適應臨床醫(yī)學檢測。在近幾年里，F(xiàn)ISH有了日新月異的發(fā)展。

目前，隨著環(huán)境污染的不斷加重，近幾年流產(chǎn)有增高趨勢。遺傳學家對大量流產(chǎn)兒進行了與遺傳有關的細胞核內(nèi)染色體的研究。發(fā)現(xiàn)50%-60%的流產(chǎn)兒，具有異常染色體，這種染色體異常，包括數(shù)目異常和結構異常。正由于這些染色體異常而導致了胚胎發(fā)育的障礙，造成妊娠中斷。導致胎兒染色體異常的原因主要有兩種：一種是環(huán)境中的致畸胎因素，如放射線、病毒和某些藥物等。各種致畸胎因素作用于生殖細胞和處于早期發(fā)育的胚胎，導致胎兒染色體異常。另一種是胎兒父母的一方或雙方染色體異常，這些染色體異常的父母，往往從外表上看是正常的，并沒有發(fā)育上的缺陷，而細胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)卻發(fā)生了明顯變化，他們孕育的胚胎很大一部分為染色體異常的胎兒。染色體異常的攜帶者相當多，大約每二百五十對夫婦中就有一個。在習慣性流產(chǎn)的病人中，夫婦一方或雙方存在染色體異常的約占10%。因此，對人中期染色體異常檢測就成為臨床細胞遺傳學研究中重要部分。

然而在臨床細胞遺傳學研究中，常規(guī)的染色體顯帶技術常常存在難以分辨染色體缺失、重復及復雜、細微的相互易位等問題，染色體熒光原位雜交是在細胞水平上的一種分子技術手段，染色體熒光原位雜交技術是80年代在放射性原位雜交技術基礎上發(fā)展起來的一種非放射性的分子細胞遺傳學技術。該技術與FISH技術的結合為人類染色體畸變的研究提供了更為精確可靠的診斷依據(jù)。因而FISH技術已廣泛應用于產(chǎn)前診斷、腫瘤生物學以及哺乳動物染色體進化等研究領域，成為醫(yī)學臨床診斷中一種重要的技術手段。

本實驗將利用人的全套染色體探針，通過熒光原位雜交技術，對人中期染色體異常進行檢測。

一、染色體的制備

1.收獲細胞：用吸管吸取培養(yǎng)物，移至離心管中，以800～1000轉/分離心10分鐘，棄去上清液，留下沉淀物約0.5 ml。

2.低滲處理：加入預溫37℃的低滲液至4 ml，用吸管輕吹打混勻，置于37℃恒溫水浴鍋中低滲20分鐘，促使白細胞膨脹，染色體分散。（操作時，要注意不要將細胞吸到吸管上部，也不要接觸離心管的上部，否則會丟失許多細胞。）

3.預固定：低滲處理后，沿管壁緩緩加入1ml新配制的固定液（甲醇：冰乙酸=3:1），立即用吸管輕吹打混勻。以800轉/分離心10分鐘，棄上清液，留約0.5ml沉淀物。

4.固定液：加入新鮮固定液至5 ml，吸管吹打混勻，室溫固定20分鐘，離心，去上清液。依上方法再重復固定兩次。（固定液要新鮮配制，否則會形成酯類，影響固定效果。）

5.制備細胞懸液：離心后預留0.2～0.3 ml固定液或另加新鮮固定液（視細胞多少而定），用吸管吹打混勻，制成細胞懸液。

二、常規(guī)的細胞遺傳學分析（染色體顯帶）

（一）G－顯帶

先用空氣干燥法將中期分裂相滴在酒精浸泡并且用紙擦干凈的玻片上，然后將其放入65℃的通風烤箱中烤片3－5小時老化片子（必要時可以烤片過夜12－24小時），接著用0.005%-0.01%的胰酶/1×PBS液處理染色體玻片標本2－5分鐘（胰酶的濃度和處理的時間視不同物種和染色體標本的狀態(tài)可以調(diào)整），最后于Giemsa染色液中（Giemsa原液：KH2PO4緩沖液＝1：6稀釋，pH＝6.8）染色體3－5分鐘，水沖洗干凈，室溫空干或者用吹干，顯微鏡下觀察，對較好的G－帶分裂相拍照，并且做進一步的分析。

（二）熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization）

染色體玻片標本預處理：通常為了取得比較好的雜交效果，要預處理染色體玻片標本以去除中期分裂相上面和周圍覆蓋的細胞質(zhì)和其他可以影響有效雜交的物質(zhì)。

將中期分裂相的懸液滴在玻片上，等分裂相干后，在顯微鏡底下觀察，如果分裂相周圍為比較明顯的一層物質(zhì)所籠罩，則需要下面的處理步驟。

胃蛋白酶處理：0.002-0.005%的胃蛋白酶溶液（0.01N HCl）處理3－5min

過兩次2×SSC，每次3min，最后由梯度乙醇脫水（70%－90%－100%），每次2min，空干，最后放入65℃的通風烤箱老化片子60－90min再由70%甲酰胺變形染色體標本DNA。

（三）染色體玻片標本的變性和雜交

63－68℃水浴預熱70%甲酰胺變性液，將玻片放入其中變性1－2min，立即轉入－20℃70%冰乙醇中1min；再經(jīng)梯度乙醇（70%－90%－100%）脫水；空氣風干后將經(jīng)過變性和預退火的探針混合液加到玻片上有中期分裂相的區(qū)域，用22×22蓋玻片覆蓋，用鉛筆頭小心的趕出蓋玻片下的氣泡，用膠水封好蓋玻片的邊緣后，放置在雜交盒中37℃避光雜交12－48小時（近緣物種12－24小時，遠緣48小時或者更長）。

3.雜交后洗滌

在42-45℃的50%甲酰胺/2×SSC溶液和2×SSC溶液中洗滌兩次，每次5 min；在4×T(4×SSC和0.05% Tween-20)溶液中溫育5min后，將4×T液配制的抗體加在玻片上（單色用biotin－16－dUTP標記的探針用Cy3-avidin抗體檢測，1:1000稀釋）；在37℃濕潤暗盒中反應20min后，再經(jīng)37℃4×T溶液中換洗三次，每次5min。玻片標本經(jīng)0.1μg/mlDAPI溶液復染，以抗淬滅劑AF1(Citifluor Ltd)封片。

（四）圖像觀察、拍照與處理

用安裝有CCD攝像頭的ZEISS Axioskop熒光顯微鏡觀察熒光信號，通過Genus 圖像處理軟件(Applied Imaging公司)控制拍攝并進行圖像分析。根據(jù)染色體的DAPI帶型和G-帶型，將熒光信號在染色體上進行定位。

三、結果與分析

人的22條常染色體探針以及X，Y性染色體探針在待檢測人的中期染色體分裂相上都檢測到信號。圖1是人的13，15號染色體探針與待檢測人中期染色體雜交的示意圖。圖中紅色亮點即為人的染色體特異探針與染色體標本雜交的部位。從圖中我們可以發(fā)現(xiàn)，人的染色體特異探針除了與待檢測標本的一對同源染色體雜交外，并未在其他染色體上檢測到紅色信號。這說明此人13號和15號染色體無異常。同理，我們將人的其他染色體探針與待檢測人中期染色體進行雜交，并未發(fā)現(xiàn)染色體異常情況。

四、討論

染色體顯帶雖然是細胞遺傳學分析不可缺少的基本手段，但喲內(nèi)該法所得結果的可靠性取決于收獲的中期有絲分裂相數(shù)量，染色體分散和顯帶的質(zhì)量，甚至在很大程度上取決于分析者的經(jīng)驗，即使分析者很有經(jīng)驗，對一些復雜或較小的畸變也難免作出錯誤或模糊的而FISH 技術的基本原理是用已知的標記核酸為探針，按照堿基互補的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進行異性結合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸[4]。FISH 的探針穩(wěn)定，操作安全，只須4-6h雜交，能夠直接在染色體上定性、定量標記，通過堿基互補來保證反應的特異性。在過去的15 年中，F(xiàn)ISH 技術因其與經(jīng)典的細胞遺傳學相比能更有效的對基因重排、缺失和重復進行分析，所以在染色體分析中扮演著重要的角色。熒光原位雜交技術（FISH），該技術不僅可用于中期分裂相，還可在間期細胞顯示雜交信號，尤其適用于那些培養(yǎng)難以成功的各種組織細胞。此技術是一種具有高度靈敏性和特異性的染色體分析技術，可廣泛用于各種染色體異常的檢測。

通過我們的實驗，我們認為用FISH檢測只需觀察不同顏色的信號的數(shù)目即可做出正確的診斷。既可以分析中期分裂相又可以檢測間期細胞，故其所分析的細胞數(shù)目要比常規(guī)染色體分析的多10倍之多。容易檢測出低比例的嵌合體。因而做出的結論更準確。尤其是在中期分裂相不多的時候更體現(xiàn)出FISH的優(yōu)越性。在診斷應用中染色體涂染已發(fā)展成為一個不可或缺的工具，特別是最近染色體涂染彩色核型分析的成熟，現(xiàn)在能應用于雜交為基礎的核型分析，并應用于檢測染色體畸變的初步篩選試驗。在臨床和癌癥細胞遺傳學中的大多數(shù)標記染色體很有可能將易于識別。

總之，本文利用人的染色體特異探針，建立了一套穩(wěn)定的FISH技術方法。FISH與常規(guī)的染色體顯帶分析法相比，有如下優(yōu)點：快速、不需體外培養(yǎng)、在極短的時間內(nèi)可檢測大量細胞；可對那些分散不好的分裂相作出明確診斷；能分析一部分顯帶染色體技術不易分辨的異常，如復雜易位、倒位、微小缺失、復雜畸變等；敏感性和特異性非常高。因此，F(xiàn)ISH技術可廣泛應用于臨床染色體異常檢測中。

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