治療用生物大分子免疫原性的研究進展

薛秀霞

(利津縣食品藥品監(jiān)督管理局，山東利津257400)

治療用生物大分子，包括多肽、蛋白、酶、激素、單克隆抗體等，因其具有獨特的藥理作用而成為當今醫(yī)藥研究領域的熱點，近年來相關的研究報道和上市產(chǎn)品也急劇增多，為生命科學的發(fā)展，尤其是癌癥、慢性疾病的治療帶來了新的希望。但是，這些生物大分子作為機體的外源性物質(zhì)，不可避免地會激活機體自身的免疫反應，比如形成針對藥物的抗體、激活T細胞或內(nèi)源性免疫反應等，從而減小藥物療效，甚至可能產(chǎn)生危及生命的毒副作用。如何合理地預測、減小及檢測治療用生物大分子的免疫原性是相關研究人員普遍關注的問題。本文從影響因素、改善措施、檢測手段等方面對生物大分子的免疫原性進行綜述，以期對相關研究有所幫助。

1 影響生物大分子免疫原性的因素

影響生物大分子免疫原性的因素有很多，按照產(chǎn)生的原因可分為患者相關、給藥相關及藥物相關的因素［1］。

1.1 患者因素 患者因素包括調(diào)節(jié)免疫應答的遺傳因素、免疫缺陷相關的遺傳因素和年齡?；颊叩倪z傳因素可以改變機體對藥物的免疫反應，基因的多態(tài)性可能會影響機體與生物大分子的相互作用，從而引起免疫相關的毒副作用［2］。健康的個體對天然蛋白具有一定的耐受性，同時能夠識別自身蛋白，但是免疫缺陷患者對這些蛋白可能缺乏正常的免疫耐受性，從而更有可能產(chǎn)生藥物相關的抗體［3］。另外，對用于兒童或老年患者的生物大分子來說，考慮到兒童免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟、老年患者免疫系統(tǒng)衰退的可能性，用藥時必須進行相應的免疫原性的測定。

1.2 給藥因素 給藥因素主要包括聯(lián)合用藥、給藥途徑、給藥劑量及給藥持續(xù)時間等。當生物大分子藥物與其他藥物同時使用時，不能根據(jù)單個藥物使用時免疫原性的大小來推斷聯(lián)合用藥時出現(xiàn)免疫原性的可能性。此外，給藥方式對生物大分子的免疫原性也會產(chǎn)生一定的影響，與靜脈注射相比，皮下和肌肉注射更容易發(fā)生免疫反應，一般認為是由皮下或肌肉組織中存在較多的抗原遞呈細胞引起的，也可能是藥物在局部滯留時間較長的緣故［1］。

1.3 藥物因素 藥物因素是引起機體免疫原性的主要因素，生物大分子的序列差異、糖基化作用［4］、制備工藝等都會對其免疫原性產(chǎn)生影響［5～7］。對于非人源性生物大分子藥物，人體往往會產(chǎn)生較強的免疫原性，而且這種免疫原性一般會隨著蛋白同源性的減小而增強。蛋白的糖基化作用被認為是一種減小免疫原性的方法。Karpusas等［8］將IFN－β糖基化后免疫原性有所降低，Gribben等［9］對rhGM－CSF進行糖基化后也得到了類似的結果，推測可能是糖基側(cè)鏈遮蔽了生物大分子產(chǎn)生免疫原性的活性位點，但是Ilchmann等［10］將卵清蛋白糖基化后卻增加了它的T細胞免疫原性，其原因有待進一步考證。為得到高純度、穩(wěn)定性好、安全、有效的蛋白產(chǎn)品，生物制品的生產(chǎn)一般要歷時數(shù)月，包括宿主細胞的培養(yǎng)、原始細胞庫的建立及蛋白的生產(chǎn)、純化、分析、制劑、儲存等過程，這些過程中任何微小的改變都有可能改變藥物的有效性、毒性及免疫原性。生物大分子在生產(chǎn)過程中要經(jīng)過諸多復雜的步驟，每一步都有可能導致最終所得大分子的結構的改變，蛋白在降解過程中可能產(chǎn)生具有更強免疫原性的抗原決定簇，從而增加其免疫原性;曾有報道無免疫原性的人血白蛋白作為干擾素α－2a的輔料時會導致蛋白的聚集及蛋白制劑的免疫原性的增加。此外，生物大分子生產(chǎn)過程中采用的容器也可能影響蛋白的免疫原性，玻璃容器的表面、氣液界面、潤滑劑等可以介導蛋白的變性，而塑料和橡膠中的鄰苯二甲酸酯可能會導致變應原性的產(chǎn)生和免疫原性的增加。

2 減小生物大分子免疫原性的方法

治療用生物大分子引起的免疫原性不僅會減弱藥物的療效，而且有可能產(chǎn)生毒副作用，甚至危及生命，因此有必要采取一定的措施降低此類藥物的免疫原性?，F(xiàn)有的減小生物大分子免疫原性的方法有:增加蛋白的人源序列，改善蛋白溶解特性，去除抗體表位，PEG化，鑒別和去除Ⅱ類MHC配位等。

2.1 增加人源序列 為減小鼠源生物大分子存在的人抗鼠抗體反應，人們采用的方法有:以鼠的活性區(qū)和人的恒定區(qū)制備嵌合抗體，將鼠的互補決定區(qū)(CDR)接到人類抗體的骨架上制備人化抗體以及通過噬菌體展示技術或轉(zhuǎn)基因技術制備完全的人類抗體。這幾種方法往往可以極大地減小生物大分子的免疫原性［11］。但是，即使是人類抗體也不能完全避免生物大分子類藥物免疫原性的產(chǎn)生，僅僅通過增加人源化序列還遠遠不夠。

2.2 改善溶解特性 蛋白的聚集體往往比蛋白本身的免疫原性要大得多，因此使蛋白聚合最小化、改善其溶解性可以有效地降低蛋白藥物的免疫原性，一般認為蛋白的溶解性問題可以通過優(yōu)化表達、純化、制劑、溶解的條件來解決，但是與聚集相關的免疫原性問題有時卻相當棘手［11］。

2.3 去除抗體表位 去除抗體表位是較為理想的方法，抗體表位一般位于蛋白表面的少數(shù)幾個不連續(xù)位點上，僅僅幾個殘基就有可能具有很強的抗體結合親和力，對這些抗體表位的關鍵殘基進行修飾可減小其親和力。例如，通過去除B細胞表位可有效減小非人源蛋白引起的免疫原性，靶向于CD22和CD25的免疫毒素對耐藥性毛樣細胞白血病及其他惡性腫瘤產(chǎn)生了完全的緩解作用。但免疫細胞抗體表位的鑒別也是極為困難的事情［12］。最近發(fā)展的T細胞表位定位工具有助于鑒別、修飾與免疫原性相關的T細胞表位，為去除抗體表位提供了新的希望［13］。然而，多次使用這種變異蛋白也可能產(chǎn)生針對新的表位的免疫反應。

2.4 PEG化 蛋白的PEG化可通過增加蛋白的溶解性和減少用藥次數(shù)來減小免疫原性。PEG化可有效減小治療酶如精氨酸酶、天冬酰胺酶、嘌呤核苷磷酸化酶的免疫原性，因為PEG化阻礙了抗體的結合但并不妨礙小分子底物的擴散。但對于其他生物大分子而言，阻礙抗體的結合位點和保留受體結合位點往往不能兼顧。以重組人角質(zhì)化細胞生長因子2(rhKGF－2)為例，rhKGF－2的N端PEG化后免疫原性顯著減小，但是其有絲分裂促進活性也下降了約40%［14］。An QX等［15］也發(fā)現(xiàn)，PEG化后天花粉蛋白的免疫原性降低4倍左右，血漿中半衰期延長為原來的6倍，但也同樣存在蛋白活性降低的問題。

2.5 鑒別和去除Ⅱ類MHC配位 通過鑒別和去除生物大分子的Ⅱ類MHC配位，可以避免與免疫原性相關的高親和性IgG抗體的產(chǎn)生。相對于去除抗體表位而言，去除Ⅱ類MHC配位來降低免疫原性的方法更為可行，因為影響結合的因素更確定，結合位點的變化小得多，MHC分子及其結合專一性較為恒定。通過計算和實驗的方法鑒別MHC配位后，可以采用誘發(fā)突變的方法產(chǎn)生不與MHC相互作用的變異序列，但通過實驗的方法來選擇免疫原性低的序列的效率較低，獲得的較為理想的序列十分有限，而采用合理的蛋白設計方法如蛋白設計自動化(PDA)技術等可以發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定、活性好、免疫原性低的生物大分子［11］。

3 免疫原性的檢測方法

鑒于治療用生物大分子存在免疫原性的可能性，建立一種可行的方法來檢測、定量和表征機體的免疫反應是相當必要的?，F(xiàn)有的檢測免疫原性的方法主要有:酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、放射免疫法(RIA)、表面等離子體共振法(SPR)、酶聯(lián)免疫斑點法(ELISpot)、免疫PCR法(IPCR)、細胞增殖實驗等，具體應用哪一種檢測方法取決于生物大分子的類型及研究的目的［16］，而采用多種檢測方法和多種受試對象有助于提高檢測的準確性［17］。

3.1 ELISA 在檢測免疫原性的各種方法中，ELISA因其能夠高選擇性、高靈敏度地檢測特異性抗體而最為常用。在動物實驗中，常以ELISA測定IgG、IgE的水平作為免疫原性強弱的指標［15］。臨床試驗中，Phillips等［18］采用 ELISA 法測定了病人服用干擾素β－1a(Avonex)后血中的IgG水平，證明不含人血白蛋白(HAS)的載藥注射器劑型具有較低的免疫原性。

3.2 RIA RIA是利用放射性同位素標記的抗原和非標記抗原同時與數(shù)量有限的特異性抗體之間發(fā)生競爭性結合來測定免疫反應的方法。RIA技術極其敏感而又極其特異，可用于測定生物樣品中抗體的含量［19］。但是RIA測定的指標是放射性同位素的放射強度，對儀器的要求比較高，而且要采取必要的防輻射措施，因此該法的實際應用不如ELISA普遍。

3.3 SPR SPR可以檢測濃度極低或親和力極小的抗體，是檢測抗體的極為有利的手段。Nechansky［20］對ELISA和SPR進行了比較，認為對于直接ELISA，使用人抗的檢測試劑不能用于人源化抗體的檢測;對于雙抗ELISA，必須精心優(yōu)化試劑的濃度，檢測試劑之間的反應復雜，檢測過程費時費力等。而SPR技術無需二抗就能實時檢測對某一配體的結合，靈敏度和選擇性優(yōu)于ELISA。除此之外SPR還可同時給出定性和定量的結果、可檢測結合抗體的等型，并適用于親和力小的抗體的檢測。SPR操作簡單、檢測快速靈敏的優(yōu)點在檢測復雜生物樣品中發(fā)揮著重要的作用［21，22］，但SPR昂貴的價格也極大地限制了其應用。

3.4 ELISpotELISpot的原理類似于ELISA，也是檢測細胞產(chǎn)生的細胞因子或其他可溶性蛋白的方法，但它不僅能測定細胞因子生成量，還可通過計數(shù)檢測分泌此細胞因子的細胞頻率，靈敏度要高于ELISA，而且實驗采用的捕獲抗體不會影響活化細胞分泌細胞因子，因而近年相關的報道也不斷增加［22，23］。

3.5 IPCR IPCR也是在ELISA的基礎上建立起來的新方法，用PCR擴增代替ELISA的酶催化底物顯色。PCR具有很強的放大能力，可以定量地檢測DNA和RNA，具有非常高的敏感性和特異性，因此，將與抗原結合的特異抗體通過連接分子與DNA結合，再經(jīng)PCR擴增定量檢測抗原使得IPCR的靈敏性高于ELISA。Spengler等［24］發(fā)現(xiàn)，與對應的ELISA比較，IPCR至少可使抗體檢測的靈敏度提高1 000倍，而且本法中僅僅采用稀釋的方法就可以消除生物樣品中基質(zhì)的干擾。

3.6 細胞增殖實驗 與免疫相關的T細胞或B細胞增殖實驗是免疫原性測定的又一方法。T細胞或B細胞的數(shù)量直接影響到它們釋放的細胞因子的數(shù)量，進而影響機體的免疫反應，因此以生物大分子特異性免疫細胞的數(shù)量作為免疫原性測定指標的研究也多有報道［10］。

4 小結

隨著治療用生物大分子的廣泛研究和應用，相關藥物的免疫原性也日益受到關注。生物大分子的免疫原性受到患者、給藥及藥物相關的多種復雜因素的影響，雖然至今尚不能完全解釋產(chǎn)生免疫原性的原因，但是一些減小免疫原性的切實可行的方法逐漸發(fā)展起來，如增加大分子的人源序列，去除抗體表位，PEG化等。同時，免疫原性的各種檢測方法也應運而生，如 ELISA、RIA、SPR、ELISpot、IPCR、細胞增殖實驗等技術使復雜生物樣品中含量極低的抗體的檢測得以實現(xiàn)。雖然人們在生物大分子的免疫原性弱化及檢測方面尚處于探索階段，但隨著不斷深入的理論認識及日新月異的生物技術的發(fā)展，必將會開發(fā)出強效、穩(wěn)定以及免疫原性較弱的生物大分子藥物，治療用生物大分子藥物將擁有更加廣闊的應用前景。

［1］Jahn EM，Schneider CK.How to systematically evaluate immunogenicity of therapeutic proteins–regulatory considerations［J］.N Biotechnol，2009，25(5):280 －286.

［2］古宏標，杜勇，黃瑋俊，等.我國漢族人群免疫球蛋白α1基因增強子區(qū)域hs1，2 VNTR多態(tài)性與高加索人種的比較［J］.中山大學學報(醫(yī)學科學版)，2005，26(2):134－137.

［3］Schellekens H.Immunogenicity of therapeutic proteins:clinical implications and future prospects［J］.Clin Ther，2002，24(11):1720 －1740.

［4］Schellekens H.Bioequivalence and the immunogenicity of biopharmaceuticals［J］.Nat Rev Drug Discov，2002，1(6):457－462.

［5］Sharma B.Immunogenicity of therapeutic proteins.Part 1:Impact of product handling［J］.Biotechnol Adv，2007，25(3):310－317.

［6］Sharma B.Immunogenicity of therapeutic proteins.Part 2:Impact of container closures［J］.Biotechnol Adv，2007，25(3):318－324.

［7］Sharma B.Immunogenicity of therapeutic proteins.Part 3:Impact of manufacturing changes［J］.Biotechnol Adv，2007，25(3):325 －331.

［8］Karpusas M，Whitty A，Runkel L，et al.The structure of human interferon － beta:implications for activity［J］.Cell Mol Life Sci，1998，54(11):1203 － 1216.

［9］Gribben JG，Devereux S，Thomas NS，et al.Development of antibodies to unprotected glycosylation sites on recombinant human GM － CSF［J］.Lancet，1990，335(8687):434－437.

［10］Ilchmann A，Burgdorf S，Scheurer S，et al.Glycation of a food allergen by the Maillard reaction enhances its T－cell immunogenicity:Role of macrophage scavenger receptor class A type I and II［J］.J Allergy Clin Immunol，2010，125(1):175 －183.

［11］Chirino AJ，Ary ML，Marshall SA.Minimizing the immunogenicity of protein therapeutics［J］.Drug Discov Today，2004，9(2):82 －90.

［12］Nagata S，Pastan I.Removal of B cell epitopes as a practical approach for reducing the immunogenicity of foreign protein － based therapeutics［J］.Adv Drug Deliv Rev，2009，61(11):977 －985.

［13］Weber CA，Mehta PJ，Ardito M，et al.T cell epitope:Friend or Foe?Immunogenicity of biologics in context［J］.Adv Drug Deliv Rev，2009，61(11):965 －976.

［14］Huang ZF，Ni CY，Chu YH，et al.Chemical modification of recombinant human keratinocyte growth factor 2 with polyethylene glycol improves biostability and reduces animal immunogenicity［J］.J Biotechnol，2009，142(3 －4):242 －249.

［15］An QX，Lei YF，Jia N，et al.Effect of site － directed PEGylation of trichosanthin on its biological activity，immunogenicity，and pharmacokinetics［J］.Biomol Eng，2007，24(6):643－649.

［16］Shankar G，Pendley C，Stein KE.A risk－based bioanalytical strategy for the assessment of antibody immune responses against biological drugs［J］.Nat Biotechnol，2007，25(5):555 －561.

［17］Dobrovolskaia MA，Germolec DR，Weaver JL.Evaluation of nanoparticle immunotoxicity［J］.Nat Nanotechnol，2009，4(7):411 －414.

［18］Phillips JT，Rice G，F(xiàn)rohman E，et al.A Multicenter，Open－ Label，Phase II Study of the Immunogenicity and Safety of a New Prefilled Syringe(Liquid)Formulation of Avonex in Patients with Multiple Sclerosis［J］.Clin Ther，2004，26(4):511－521.

［19］Svenson M，Geborek P，Saxne T，et al.Monitoring patients treated with anti－TNF－α biopharmaceuticals:assessing serum infliximab and anti － infliximab antibodies［J］.Rheumatology(Oxford)，2007，46(12):1828 －834.

［20］Nechansky A.HAHA – nothing to laugh about.Measuring the immunogenicity(human anti－h(huán)uman antibody response)induced by humanized monoclonal antibodies applying ELISA and SPR technology［J］.J Pharm Biomed Anal，2010，51(1):252 －254.

［21］Sickert D，Kroeger K，Zickler C，et al.Improvement of drug tolerance in immunogenicity testing by acid treatment on Biacore［J］.J Immunol Methods，2008，334(1 － 2):29－36.

［22］Koren E，De Groot AS，Jawa V，et al.Clinical validation of the“in silico”prediction of immunogenicity of a human recombinant therapeutic protein［J］.Clin Immunol.2007，124(1):26－32.

［23］王若崢，譚遙，王多明，等.酶聯(lián)免疫斑點法檢測鼻咽癌患者放療前后T細胞對EB病毒肽段的特異性反應［J］.腫瘤防治研究，2009，36(11):928 －931.

［24］Spengler M，Adler M，Jonas A，et al.Immuno－ PCR assays for immunogenicity testing［J］.Biochem Biophys Res Commun，2009，387(2):278 －282.