玻璃化與程序化對人早期胚胎冷凍復(fù)蘇效果觀察

張若鵬，吳 睿，張麗蓉，朱 莉

（大理學(xué)院附屬醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)科，云南 大理 671000）

胚胎冷凍是體外受精-胚胎移植重要衍生技術(shù)。玻璃化冷凍方法保存胚胎于1998年Mukaida等首次報道玻璃化冷凍保存人類卵裂期胚胎獲得成功[1]。2004年王俊霞等報道了我國第1例早期胚胎應(yīng)用玻璃化冷凍方法后獲得分娩[2]。該方法能夠克服程序冷凍方法設(shè)備昂貴、耗時長、費(fèi)用高、難以避免冷凍過程中冰晶形成對胚胎的損傷等缺點(diǎn)，有望獲得更高的胚胎存活率。目前已成為體外受精-胚胎移植中研究的熱點(diǎn)并在臨床上得到迅速的推廣與應(yīng)用。我科于2010年4月至今，將玻璃化冷凍技術(shù)臨床應(yīng)用于臨床，取得滿意的效果，本文對進(jìn)行程序化和玻璃化凍融胚胎移植69周期進(jìn)行回顧性分析，比較2種冷凍方法對人早期胚胎的冷凍復(fù)蘇效果。

對象與方法

一、一般資料：2010年4月至今在本科接受凍融胚胎移植69周期，玻璃化冷凍復(fù)蘇32個周期，程序化冷凍復(fù)蘇37個周期。不孕原因主要是男方因素與女方輸卵管因素及排卵障礙，排除子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤和其他可能影響胚胎著床的因素?；颊叩钠骄挲g、不孕年限和子宮內(nèi)膜厚度組間均無顯著性差異（P>0.05），具有可比性。

二、冷凍胚胎的選擇標(biāo)準(zhǔn)：參照中華醫(yī)學(xué)會編著[3]的卵裂期第2天胚胎四級評分法。1級：胚胎發(fā)育速度正常，卵裂球均勻、數(shù)目均等，細(xì)胞質(zhì)均一、無空泡，碎片不超過5%；2級：胚胎發(fā)育速度正常，卵裂球均勻或大致均勻、數(shù)目均等或大致均等,細(xì)胞質(zhì)均一、無空泡，碎片5%～10%；3級：胚胎發(fā)育大致正常，卵裂球不均勻/均勻、數(shù)目不均等/均等，細(xì)胞質(zhì)中有少量空泡，少于15%碎片；4級：胚胎發(fā)育速度異常，卵裂球不均勻、數(shù)目不均等，細(xì)胞質(zhì)不均一、有大量空泡，10%～50%碎片。

三、玻璃化法：①胚胎冷凍 解凍試劑盒采用日KITAZATO公司的玻璃化冷凍、解凍試劑套盒,冷凍載桿為cryotop。在室溫下將胚胎（最多3枚）移入平衡液（equilibration solution）中，胚胎首先皺縮,然后逐漸擴(kuò)張，最后基本恢復(fù)至原狀，預(yù)平衡約5～7min，之后移入玻璃化冷凍液(vitrification solution)中，充分混合后迅速將胚胎置于cryotop的頂端，并迅速投入液氮中,時間控制在60s之內(nèi)。②胚胎解凍 將cryotop從液氮中取出后,迅速將其頂端置入37℃預(yù)溫的解凍液（thaw solution）中約1min，然后在室溫下將胚胎依次轉(zhuǎn)人稀釋液（dilute solution）、洗滌液1（wash solution 1）、洗滌液2（wash solution 2）中，分別停留3、5、5min,最后將胚胎移入胚胎培養(yǎng)液中，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2h后以備移植。

四、程序化法：①胚胎冷凍 將胚胎經(jīng)過溶液F1[體積分?jǐn)?shù)20%人血清白蛋白SSS]平衡10min,再移入F2[（1.5mol/L丙二醇（PROH）+體積分?jǐn)?shù)20%SSS)]平衡10min,隨后移入F3（1.5 mol/LPROH+0.1mol/L蔗糖+體積分?jǐn)?shù)20%SSS）平衡10 min,將標(biāo)本裝入程序降溫儀（澳大利亞CL3500）進(jìn)行凍，起始溫度20℃，以-2℃/min逐步降溫于-7℃穩(wěn)定5min后進(jìn)行植冰，停留10min后以-0.3℃/min緩慢降溫至-30℃，之后以-30℃/min迅速降溫至-197℃，標(biāo)本取出迅速投入液氮中保存。②胚胎解凍 采用快速解凍法解凍胚胎，將胚胎從液氮中取出后，30℃水浴30 s，室溫下放置30 s后投入0.2mol/L蔗糖＋1.0mol/LPROH 5min，再投入0.2mol/L蔗糖＋0.5mol/LPROH 5min，再入0.2mol/L蔗糖5min，轉(zhuǎn)入胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)，待移植。

五、胚胎解凍后的觀察：胚胎解凍后判定胚胎存活的標(biāo)準(zhǔn)是 胚胎卵裂球數(shù)50%以上完整并存活，顏色明亮均一，立體感較強(qiáng)；卵裂球存活的標(biāo)準(zhǔn)是 具有完整清晰的細(xì)胞膜、胞質(zhì)均勻光澤、立體感強(qiáng)。

六、凍融胚胎移植及臨床妊娠的確認(rèn)：解凍當(dāng)日選擇存活的胚胎進(jìn)行宮腔內(nèi)移植，移植14d后測定血或尿人絨毛膜促性腺激素水平，移植35d后行B超監(jiān)測，見有孕囊者，確認(rèn)為臨床妊娠。

七、統(tǒng)計學(xué)方法：使用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析，組間比較主要采用t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

玻璃化冷凍復(fù)蘇32個周期的102枚早期胚胎，存活92枚，胚胎存活率為90.20%（92/102）。胚胎種植率為19.57%（18/92），妊娠率31.25%（10/32），2011年4月24日滇西首例玻璃管化試管女嬰兒健康問世。程序化冷凍復(fù)蘇37個周期，解凍122個胚胎,存活67個，復(fù)蘇存活率為55.0%（67/122），胚胎種植率為10.44%（7/67），妊娠率10.81%（4/37）。玻璃化組的復(fù)蘇存活率、胚胎種植率、臨床妊娠率均高于程序化組（P＜0.05）。

討 論

本研究顯示相對程序化冷凍，玻璃化冷凍保存人類早期胚胎，胚胎復(fù)蘇存活率、種植率、臨床妊娠率均高于程序化組（P＜0.05），是冷凍保存人類胚胎的理想方法，提示玻璃化法凍融胚胎有較好的復(fù)蘇效果和發(fā)育潛能。在冷凍過程中，胚胎會發(fā)生多種冷凍損傷，其中冰晶的形成是造成冷凍損傷的最主要因素[4]。程序化冷凍技術(shù)難以杜絕冰晶造成的冷凍損傷。解凍后的胚胎有3種表現(xiàn)：全部卵裂球完整、部分卵裂球完整和所有卵裂球損傷死亡。通常以解凍后胚胎復(fù)蘇的卵裂球細(xì)胞數(shù)≥總細(xì)胞數(shù)的50%作為可移植胚胎的標(biāo)準(zhǔn)。玻璃化冷凍一方面冷凍保護(hù)劑濃度高，卵裂球脫水充分，另一方面由于溫度快速下降，不易形成冰晶，減少了胚胎或細(xì)胞的機(jī)械性損傷，減少了由于沒有可移植胚胎而導(dǎo)致的周期取消率。此外玻璃化冷凍法還能克服程序化冷凍的一些缺點(diǎn)，比如昂貴的程序化冷凍儀的運(yùn)行損耗大、冷凍耗時長、多管胚胎同時冷凍時等待時間延長等，而且如果冷凍儀在運(yùn)行中出現(xiàn)故障，將會給胚胎帶來無法挽回的損傷。因而玻璃化法是更適合中國國情的理想的冷凍技術(shù)，有望在冷凍人類卵子、胚胎中得到廣泛的運(yùn)用。綜上所述，玻璃化法冷凍胚胎的復(fù)蘇效果明顯好于程序化法，玻璃化法能夠較好地保存冷凍胚胎復(fù)蘇后的發(fā)育潛能，適用于卵裂期胚胎的冷凍保存。

［1］ MUKAIDA T,WADA S,TAKAHASHIK,etal.Vitrification of human embryos based on the assessment of suitable conditions[J]．Hum Reprod,l998,13:2874-2879.

［2］ 王俊霞,朱桂金,魏玉蘭,等.應(yīng)用胚胎玻璃化冷凍技術(shù)獲得臨床妊娠及分娩1例[J]．中華婦產(chǎn)科雜志,2004,39(2):143.

［3］ 中華醫(yī)學(xué)會，編著.輔助生殖技術(shù)和精子庫臨床技術(shù)操作規(guī)范[M]．北京：人民軍醫(yī)出版社，2010:50-51.

［4］ KASAI M,ZHU SE,PEDRO PB,e tal.Fracture damage ofembryosand its prevention during vitrification and warming[J]．Cryobiology,2009,33(4):459-464.