16種中藥對(duì)水貂綠膿桿菌的體外抑菌試驗(yàn)

張傳美，劉海生，楊海燕，楊瑞梅，秦志華，單 虎

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島266109）

綠膿桿菌（P.aeruginosa）或稱(chēng)銅綠色假單胞菌，為假單胞菌屬（Pseudomonas）成員，是臨床上較常見(jiàn)的條件致病菌之一，可引起各種繼發(fā)或混合感染，亦可作為原發(fā)性病原引起水貂、家禽、兔、羊等動(dòng)物發(fā)病。近幾年來(lái)，隨著養(yǎng)貂規(guī)模的擴(kuò)大，臨床上由綠膿桿菌引起的水貂出血性肺炎日益增多。綠膿桿菌具有多重耐藥的特性，加之臨床上抗生素的濫用，綠膿桿菌耐藥的問(wèn)題日益嚴(yán)重［1］。因此，獸醫(yī)臨床急需尋找低毒有效的抗生素的替代品，以控制疾病的發(fā)生。許多研究表明，中藥或天然植物提取物，可發(fā)揮對(duì)病原菌直接殺滅作用或提高機(jī)體免疫力達(dá)到防治疾病的目的［2-3］。為此，本試驗(yàn)對(duì)五味子等16種中藥，通過(guò)抑菌試驗(yàn)研究其對(duì)綠膿桿菌標(biāo)準(zhǔn)株和分離株的抑菌效果，旨在篩選出對(duì)綠膿桿菌有抑菌作用的藥物，指導(dǎo)臨床合理用藥。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 中藥 五味子，訶子，五倍子，石榴皮，烏梅，黃芪，太子參，金銀花，連翹，黃連，射干，穿心蓮，貫眾，大黃，蒼術(shù)，丁香。每味藥50g，均購(gòu)自青島市城陽(yáng)區(qū)同仁堂藥店。

1.1.2 菌種 綠膿桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC27853為山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院惠贈(zèng)；分離株為山東省預(yù)防獸醫(yī)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從臨床發(fā)病水貂分離鑒定保存。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基，普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂。

1.2 方法

1.2.1 菌種的培養(yǎng) 取冰箱中的綠膿桿菌標(biāo)準(zhǔn)株和分離株的菌種用普通瓊脂培養(yǎng)，接種后置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌種復(fù)壯后接種于LB液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)6h后，按照1∶10 000稀釋。

1.2.2 藥液的制備 取16種中藥各50g，浸泡30min，取各藥分別水煎2次后濃縮。生藥含量為1 000mg／mL，然后進(jìn)行倍比稀釋。滅菌后置冰箱備用，具體方法參見(jiàn)文獻(xiàn)［4］。

1.2.3 抑菌試驗(yàn) 采用瓊脂平板打孔法［5］，普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂20mL傾注入直徑9cm的平皿內(nèi)，凝固后其厚度為4mm～5mm，用移液槍吸取200μL的細(xì)菌稀釋液，均勻涂布于瓊脂表面，待菌液被吸收后，用直徑為6mm的無(wú)菌打孔器均勻打孔，5孔／板?？组g距大于20mm，依次滴加中藥倍比稀釋液，中間孔加入滅菌蒸餾水作對(duì)照。以剛剛注滿(mǎn)為準(zhǔn)，每種中藥作2個(gè)重復(fù)。將平板37℃培養(yǎng)12h～18h后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。以2孔的平均值表示該中藥的抑菌作用大小。

1.2.4 判斷標(biāo)準(zhǔn) 抑菌效果判定標(biāo)準(zhǔn)均按《中藥藥理學(xué)》標(biāo)準(zhǔn)即：抑菌圈直徑＜10mm為耐藥（-）。10mm～15mm為中度敏感（＋），15mm以上為高度敏感（＋＋）。

2 結(jié)果

2.1 16種中藥對(duì)綠膿桿菌標(biāo)準(zhǔn)株的抑菌效果

采用打孔法測(cè)定了16種中藥對(duì)綠膿桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑菌圈直徑，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，五倍子對(duì)綠膿桿菌標(biāo)準(zhǔn)株的抑菌效果最好，1 000 mg／mL濃度的藥液抑菌圈直徑達(dá)26.5mm。五味子和訶子也有較好的抑菌作用，1 000mg／mL濃度抑菌圈直徑達(dá)23.5mm。其次為石榴皮、烏梅和黃連，對(duì)綠膿桿菌標(biāo)準(zhǔn)株也有一定抑菌作用。射干、連翹和金銀花抑菌效果較差，抑菌圈直徑均小于10 mm。穿心蓮、貫眾、黃芪、太子參、大黃、蒼術(shù)、丁香7味中藥各稀釋度對(duì)綠膿桿菌標(biāo)準(zhǔn)株抑菌圈直徑均為0，無(wú)抑菌作用（在表1中未列出）。

表1 16種中藥對(duì)綠膿桿菌標(biāo)準(zhǔn)株的抑菌效果Table 1 Bacteriostatic effect of 16kinds of traditional Chinese medicines on standard strains of P.aeruginosa

2.2 16種中藥對(duì)綠膿桿菌分離株的抑菌效果

采用打孔法測(cè)定了16種中藥對(duì)綠膿桿菌分離菌株的抑菌圈直徑，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，訶子對(duì)綠膿桿菌分離株的抑菌效果最好，1 000mg／mL濃度的藥液抑菌圈直徑達(dá)24mm。其次為五倍子和五味子，1 000mg／mL濃度的藥液抑菌圈直徑達(dá)21mm。黃連、石榴皮、烏梅、金銀花和連翹對(duì)綠膿桿菌分離株也有一定抑菌作用。大黃和射干抑菌效果較差，抑菌圈直徑均小于10mm。黃芪、太子參、穿心蓮、貫眾、蒼術(shù)、丁香6味中藥各稀釋度對(duì)綠膿桿菌分離株抑菌圈直徑均為0，無(wú)抑菌作用（在表2中未列出）。

表2 16種中藥對(duì)綠膿桿菌分離株的抑菌效果Table 2 Bacteriostatic effect of 16kinds of traditional Chinese medicines on separation strains of P.aeruginosa

3 討論

水貂出血性肺炎是由綠膿桿菌引起的貂的一種急性敗血性傳染病，臨床表現(xiàn)為呼吸困難、咯血、死前鼻孔流出紅色泡沫性液體，剖檢病變主要在肺部，肺腫大，呈深紅色肝樣變，切開(kāi)時(shí)流出大量血樣泡沫，肺門(mén)淋巴結(jié)腫大，氣管和支氣管黏膜呈桃紅色等。近年來(lái)，綠膿桿菌感染已漸趨增多，且耐藥菌株不斷增加。因此，從天然藥物中尋找高效的抗菌藥物就更顯重要。五倍子、五味子、訶子、石榴皮和烏梅5味中藥均為斂肺澀腸藥，具有斂肺止咳、生津斂汗、澀腸止瀉的功效［6］，故用五倍子等收澀藥來(lái)治療水貂的出血性肺炎符合中醫(yī)治療疾病的理論［7-8］。本試驗(yàn)證明五倍子、五味子、訶子、石榴皮和烏梅5味中藥對(duì)綠膿桿菌有相當(dāng)好的殺菌效果，其中五倍子、訶子和五味子中藥在濃度很低的情況下，也會(huì)對(duì)綠膿桿菌產(chǎn)生抑菌效果，并且中藥還不易產(chǎn)生耐藥性，這些都為臨床上中藥治療水貂綠膿桿菌病提供強(qiáng)有力的科學(xué)依據(jù)［9］。試驗(yàn)藥物中，黃連、金銀花、連翹和射干等清熱類(lèi)中藥也有一定抑菌效果，黃芪和太子參等補(bǔ)益類(lèi)中藥以及穿心蓮、貫眾、蒼術(shù)、丁香和大黃均無(wú)抑菌作用［10］。這表明補(bǔ)益類(lèi)藥物的抑菌作用不如清熱解毒類(lèi)藥物。此試驗(yàn)與陳娟等［11］的試驗(yàn)結(jié)果相似。本試驗(yàn)僅通過(guò)抑菌試驗(yàn)對(duì)16種中藥的藥效進(jìn)行比較，究竟療效如何，還有待于實(shí)際臨床進(jìn)一步驗(yàn)證。

［1］ 王玉飛.52株綠膿桿菌臨床分離株的耐藥狀況分析及耐藥質(zhì)粒檢測(cè)［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2002，18（6）：656-657.

［2］ 夏美玲，呂麗艷，劉 野，等.5種中草藥體外抑菌實(shí)驗(yàn)的研究［J］.黑龍江齊齊哈爾：齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，30（24）：3024-3025.

［3］ 于 軍，徐麗華，王 云，等.射干和馬齒莧對(duì)46株綠膿桿菌體外抑菌試驗(yàn)的研究［J］.白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，27（2）：130-131.

［4］ 曾祥吉，李東霞.中藥抑菌實(shí)驗(yàn)方法的研究［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011 20（4）：518-520.

［5］ 謝仲權(quán)，牛樹(shù)琦，劉鳳華.天然物中草藥飼料添加劑研究方法［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2001.

［6］ 黃 玲，林居純，馬 馳，等.12種中藥的體外抑菌試驗(yàn)［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31（6）：50-52.

［7］ 楊燁建，柳益群，張勁豐，等.黃連和五倍子對(duì)耐萬(wàn)古霉素腸球菌的體外抗菌活性［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，28（5）：819-820.

［8］ 李仲興，張立志，王秀華，等.五倍子對(duì)140株腸球菌的抑菌效果觀察［J］.中草藥，2003，34（1）：56-58.

［9］ 鐘有添，馬廉蘭.中草藥和常用抗生素對(duì)綠膿桿菌的抑菌實(shí)驗(yàn)［J］.贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，21（3）：244-245.

［10］ 代 敏，彭 成，萬(wàn) 峰，等.十七味清熱類(lèi)中藥對(duì)乳牛乳腺炎病原菌體外抑菌活性的比較［J］.中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2010，40（12）：1299-1306.

［11］ 陳 娟，肖 洋，池 明，等.10種清熱解毒類(lèi)中藥對(duì)綠膿桿菌體外抑菌試驗(yàn)的研究［J］.吉林醫(yī)學(xué)，2006，27（11）：1386-1387.