仔豬感染豬繁殖與呼吸綜合征病毒的病毒定位研究

桑傳蘭，王 蕭＊，多海剛，陳 嘉，梁 朗，董浩然

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣東廣州510405；2.廣東藍(lán)島生物技術(shù)有限公司，廣東廣州510555）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproduction and respiratory syndrome，PRRS）是20世紀(jì)80年代末期90年代初期出現(xiàn)的一種病毒性傳染病，PRRS主要引起母豬和后備母豬的繁殖障礙和仔豬的呼吸道癥狀。近年來(lái)關(guān)于PRRS的病原學(xué)、流行病學(xué)、臨床癥狀和血清學(xué)診斷等方面已有大量報(bào)道，但至今對(duì)本病的發(fā)病機(jī)理還不清楚。本試驗(yàn)旨在用天津地區(qū)分離株P(guān)RRSV-SJ株滴鼻感染10日齡～15日齡PRRSV陰性的健康仔豬，觀察PRRSV在仔豬體內(nèi)靶器官的分布規(guī)律，明確其病毒的致病特點(diǎn)和發(fā)展規(guī)律，為進(jìn)一步研究PRRSV的致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為制定科學(xué)的防控措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物 10日齡～15日齡健康的仔豬20頭，經(jīng)美國(guó)IDEXX公司PRRSV ELISA試劑盒檢測(cè)為陰性，購(gòu)自天津種豬場(chǎng)。

1.1.2 試驗(yàn)用病毒 PRRSV-SJ株由天津畜牧獸醫(yī)研究所病毒室分離并保存，TCID50為10-5.58／0.1 mL。

1.1.3 主要試劑 PRRSV MAb 15A1來(lái)源于美國(guó)，由農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)診斷中心提供；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H＋L）為北京中山生物技術(shù)有限公司進(jìn)口分裝產(chǎn)品；50mL／L的馬血清（PBS稀釋?zhuān)楸本┲猩缴锛夹g(shù)有限公司產(chǎn)品；3.3-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽（DAB）為北京市聯(lián)合化工廠產(chǎn)品；蘇木素（hematoxylin，進(jìn)口分裝）為北京化學(xué)試劑公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 人工感染方法 15頭仔豬滴鼻接種PRRSV-SJ毒株，3mL／頭，每日測(cè)量體溫，觀察臨床癥狀，并于感染后1、7、14、21、28d各處死3頭。對(duì)照組5頭滴鼻正常細(xì)胞培養(yǎng)物，3mL／頭，與感染組相對(duì)應(yīng)的時(shí)間，各處死1頭。

1.2.2 取材 剖檢取出的氣管（中部）、肺、脾臟、扁桃體、淋巴結(jié)（肺門(mén)淋巴結(jié)、頸下淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)）腎臟等新鮮組織病料放入100 mL／L的中性緩沖福爾馬林液中固定。

1.2.3 免疫組織化學(xué)法 常規(guī)制作石蠟切片［13］，切片常規(guī)脫蠟、洗滌、封閉后，滴加稀釋比例適當(dāng)?shù)囊豢梗跐窈?7℃40min后，4℃冰箱內(nèi)過(guò)夜，滴加稀釋比例適當(dāng)?shù)睦备^(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠的IgG（二抗）。在濕盒中37℃1h，洗滌后DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度酒精脫水、封片。

2 結(jié)果

2.1 氣管

PRRSV感染1d后，病毒抗原主要分布于氣管上皮和固有膜，并且從1d～28d的感染期間，氣管中的抗原陽(yáng)性細(xì)胞分布較少，陽(yáng)性反應(yīng)也不強(qiáng)烈（圖1），陰性對(duì)照見(jiàn)圖2。

2.2 肺臟

陽(yáng)性細(xì)胞分布在肺泡間隔、肺泡壁上、支氣管及細(xì)支氣管上皮。但在感染21d～28d后，陽(yáng)性細(xì)胞少，陽(yáng)性反應(yīng)也不強(qiáng)（圖3），陰性對(duì)照見(jiàn)圖4。

2.3 肺門(mén)淋巴結(jié)

感染1d～28d，陽(yáng)性細(xì)胞主要分布在淋巴結(jié)皮質(zhì)部及生發(fā)中心周邊，陽(yáng)性細(xì)胞量多，陽(yáng)性反應(yīng)也強(qiáng)烈（圖5），陰性對(duì)照見(jiàn)圖6。

2.4 扁桃體

感染1d～28d，陽(yáng)性細(xì)胞主要分布在扁桃體的隱窩及周遍（圖7），陰性對(duì)照見(jiàn)圖8。

2.5 脾臟

感染7d后，抗原陽(yáng)性細(xì)胞少，陽(yáng)性反應(yīng)弱。感染14d～28d期間，在髓質(zhì)、皮質(zhì)區(qū)都有大量的陽(yáng)性細(xì)胞分布，陽(yáng)性反應(yīng)也很強(qiáng)（圖9），陰性對(duì)照見(jiàn)圖10。

圖1 PRRSV感染氣管Fig.1 Positive expression in nasal mucosa tissue

圖2 氣管黏膜陰性對(duì)照Fig.2 Negative expression in control nasal mucosa tissue

圖3 PRRSV感染的肺組織Fig.3 Positive expression in lung tissue

圖4 肺組織陰性照Fig.4 Negative expression in control lung tissue

圖5 PRRSV感染的肺門(mén)淋巴結(jié)Fig.5 Positive expression in Bronchpulmonary lymph tissue

圖6 肺門(mén)淋巴結(jié)陰性對(duì)照Fig.6 Negative expression in control bronchpulmonary lymph tissue

圖7 PRRSV感染的扁桃體Fig.7 Positive expression in tonsil tissue

圖8 扁桃體陰性對(duì)照Fig.8 Negative expression in tonsil tissu

圖9 PRRSV感染的脾臟組織Fig.9 Positive expression in spleen tissue

圖10 脾臟組織陰性對(duì)照Fig.10 Negative expression in spleen tissue

3 討論

用間接免疫組織化學(xué)法觀察了感染后1d～28 d的PRRSV抗原在氣管、鼻黏膜、肺、脾、腎、淋巴結(jié)、扁挑體的分布動(dòng)態(tài)。結(jié)果顯示，病毒在感染1d后，PRRSV可以在肺、氣管、淋巴結(jié)、扁挑體等組織中檢出。說(shuō)明經(jīng)鼻內(nèi)接種PRRSV-SJ株可在相應(yīng)的組織中復(fù)制和增殖，這一結(jié)果與劉萬(wàn)鈴等［1-2，5］試驗(yàn)結(jié)果相一致。

一般認(rèn)為肺臟是PRRSV作用的原發(fā)性靶器官，是該病毒的主要侵害器官［4-5］。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)肺組織中的病毒陽(yáng)性細(xì)胞分布數(shù)量和陽(yáng)性反應(yīng)程度都不如文獻(xiàn)中描述的分布廣，數(shù)量多及陽(yáng)性反應(yīng)強(qiáng)。本試驗(yàn)的結(jié)果與任慧英等［10］用原位分子雜交技術(shù)檢測(cè)仔豬肺組織中的病毒核酸陽(yáng)性結(jié)果一致。Haynes J S等［12］報(bào)道兩種不同致病性的毒株感染動(dòng)物，強(qiáng)致病性的毒株與低致病性的毒株在同一時(shí)間內(nèi)相比，強(qiáng)致病性的毒株能在更多的組織和更長(zhǎng)的時(shí)間檢出PRRSV陽(yáng)性細(xì)胞，并且在肺中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及反應(yīng)強(qiáng)度也高于低致病性毒株。本試驗(yàn)所用的PRRSV S J毒株是否屬于低致病性毒株有待于進(jìn)一步研究。

Rossw K D 等［3-6，11］認(rèn) 為 PRRSV 通 過(guò) 鼻 黏 膜或呼吸道進(jìn)入肺臟，引起肺內(nèi)巨噬細(xì)胞增生并復(fù)制病毒，病毒很快進(jìn)入肺組織血管，并在內(nèi)皮細(xì)胞中進(jìn)一步復(fù)制經(jīng)血液循環(huán)引起全身病毒血癥。本試驗(yàn)結(jié)果為，脾臟、腎臟在感染7d～28d后都可檢出PRRSV抗原陽(yáng)性細(xì)胞，但在14d～28d的抗原陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量和陽(yáng)性反應(yīng)強(qiáng)度最強(qiáng)，從本試驗(yàn)的結(jié)果分析，PRRSV是以病毒血癥的方式擴(kuò)散到小血管，毛細(xì)血管，并在這里增殖導(dǎo)致相應(yīng)的病變，脾臟、腎臟血管漏出的病毒又為大量的巨噬細(xì)胞吞噬和復(fù)制，因此在感染后期出現(xiàn)了大量的抗原陽(yáng)性細(xì)胞，在這個(gè)試驗(yàn)中，作者認(rèn)為脾是感染后期診斷和分離病毒的最佳病料。

Yoon I J等［5-6，9］研 究 發(fā) 現(xiàn)，PRRSV 感 染 12h后在鼻黏膜上皮細(xì)胞檢出PRRSV陽(yáng)性細(xì)胞，14d～21d后又再次檢出，同時(shí)檢測(cè)到鼻黏膜PRRSV病毒滴度高于血清病毒滴度，說(shuō)明PRRSV是通過(guò)鼻黏膜排毒引起本病的感染的主要原因，因此鼻黏膜可作為本病的早期診斷。本試驗(yàn)從1d～28d都能在鼻黏膜中檢出PRRSV病毒抗原，但鼻黏膜的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及陽(yáng)性反應(yīng)強(qiáng)度都不如肺門(mén)淋巴結(jié)，扁桃體強(qiáng)烈，因此扁桃體和肺門(mén)淋巴結(jié)是早期診斷本病的最佳病料。

［1］ 劉萬(wàn)鈴，余樹(shù)民，徐志文，等.PRRSV SC-1株在人工感染仔豬體內(nèi)的分布［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31（7）：36-38.

［2］ 陳申秒，馬景霞，王金生，等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒人工感染試驗(yàn)［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2011，32（1）：110-114.

［3］ 李燕華，郭 鑫，楊漢春，等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒與豬園環(huán)病毒2型共感染豬組織中豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原的分布［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2009，45（1）：9-12.

［4］ 楊 鴻，錢(qián)君娣，何啟蓋，等.病豬肺組織中PRRSV抗原免疫組織化學(xué)Envision法的原位檢測(cè)［J］.中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2009，30（3）：237-240.

［5］ Rossow K D，Benfield D A，Goyal S M，et al.Chronological immunohistochemical detection and location of porcine reproduction and respiratory syndrome virus infection in gnotobiotic pigs［J］.Vet Pathol，1996，33：551-556.

［6］ Rossow K D，Bautista E M，Goyal S M，et al.Experimental reproductive infection in one-four-ten-week-old-pigs.［J］.Vet Diagn Invest，1994，6：3-12.

［7］ HaLbur P G，Paul P S，F(xiàn)rey M，et al.Comparative pathogenicity of nine US porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）isolation in five-week-old cesarean derived，colostrums-deprived pig model［J］.Vet Diagn Invest，1996，8：11-20.

［8］ Halbur P G，Paul P S，F(xiàn)rey M，et al.Comparison of the anti-gen distribution of two U.S.porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolation with that of lelystad virus［J］.Vet Pathol，l996，33：159-170.

［9］ Yoon I J，Joo H S，Christianson W T，et al.Field isolation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRS）vary in their susceptibility to antibody dependent enhancement（ADE）of infection［J］.Vet Microbiol，1997，55：277-287.

［10］ 任慧英，李文志，楊漢春，等.應(yīng)用原位雜交技術(shù)研究母源抗體對(duì)PRRS病毒在體內(nèi)的增值的影響［J］.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2002，22（5）：372-374.

［11］ 尹訓(xùn)南，郭寶清，司昌德，等.豬生殖-呼吸綜合征病毒在仔豬體內(nèi)定位研究［J］.中國(guó)畜禽傳染病，1997（5）：47-49.

［12］ Haynes J S，Halbur P G，Sirnarumit T，et al.Temporal and morphologic characterization of the distribution of porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）by in situ hybridization in pigs infected with isolated of PRRSV that differ in virulence［J］.Vet Pathol，l997，34（1）：39-43.

［13］ 何書(shū)海，陳宏智，焦鳳超.動(dòng)物病理組織切片制作方法的改良［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2011，32（11）：130-132.