抗浪魚的核型研究

孔令富，畢保良，李蓮軍，汪 霞，王俊相，吳志蕾，李永能，李 潔

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201）

抗浪魚（Anabarilius grahami）原產(chǎn)于中國第二深高原淡水湖云南省撫仙湖，隸屬硬骨魚綱（Actinopterygii），鯉 形 目 （Cypriniformes），鯉 科 （Cyprinidae），鲌亞科（Cultrinae）白魚屬（Anabarilius）?？估唆~是一種珍稀地方魚種，20世紀(jì)90年代以后，由于過度捕撈及銀魚的引進(jìn)放養(yǎng)，撫仙湖抗浪魚的產(chǎn)量逐年下降，瀕臨滅絕。目前，關(guān)于抗浪魚的研究主要是對其生物學(xué)特性的描述，包括形態(tài)特征、生活習(xí)性、生長特點(diǎn)、繁殖習(xí)性的描述和瀕危原因的分析及對策。目前，除了對抗浪魚線粒體DNA和遺傳多樣性有部分研究［1］外，對抗浪魚的染色體的研究報(bào)道較少。

染色體是魚類遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)［2-3］，其數(shù)目和形態(tài)結(jié)構(gòu)具有該物種的特征，一定程度上也反映了生物進(jìn)化的歷史［4］，在魚類的遺傳變異中，染色體起著重要的作用，對魚類染體數(shù)量、形態(tài)與結(jié)構(gòu)的研究，在遺傳學(xué)中的基因定位、雜交以及多倍體育種等領(lǐng)域起著重要的作用［5-6］。核型是指把動物、植物、真菌等的某一種有機(jī)體或某一分類群的體細(xì)胞內(nèi)整套染色體拍攝下來，按照它們相對恒定特征排列起來的圖象。對核型作比較分析主要是確定它們之間在核型上的相同或不同特征，即核型的同源性和異源性，核型的共同特征常是鑒定不同物種或分類群之間近緣關(guān)系的重要依據(jù)，而對核型異質(zhì)性的探究是區(qū)分不同分類群的重要依據(jù)。核型特征主要有染色體二倍數(shù)（2n）、染色體分組組成或稱核型公式、染色體的臂數(shù)、染色體相對長度、臂比，次縊痕的數(shù)量等等。魚類的染色體較小，數(shù)目偏多，研究工作難度較大，進(jìn)展較為緩慢，截止2005年，已報(bào)道染色體核型的魚類有2 100種左右，約占總數(shù)10%，且大多數(shù)為淡水魚類，集中在鯉形目、鯰形目、鱸形目上。近年來，對鯉科魚類染色體研究比較多，發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)2n=100廣泛存在于鯉科魚類中，但核型卻各不相同。本研究目的在于通過對抗浪魚染色體組型的研究，為該魚種質(zhì)的細(xì)胞遺傳學(xué)檢測提供相應(yīng)的參數(shù)，為抗浪魚的系統(tǒng)演化、進(jìn)化地位的確定提供基礎(chǔ)資料，同時(shí)為抗浪魚的選育種工作提供細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)方面的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

成年健康抗浪魚8條，購自云南漫灣有限責(zé)任公司水產(chǎn)養(yǎng)殖場；甲醇、冰醋酸、KCl、生理鹽水、Giemsa染色原液、植物血凝素（phytohaemagglutinin，PHA）和秋水仙素（colchicine）為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 魚腎細(xì)胞懸液的制備、低滲處理及固定PHA經(jīng)小牛血清溶解后按10μg／g體重胸腔注射抗浪魚，14h后按1μg／g體重注射秋水仙素，3h后放血取腎，于8g／L的生理鹽水中清洗2遍～3遍，然后置于含少量生理鹽水的培養(yǎng)皿中，充分剪碎后加入適量生理鹽水，用吸管吹打數(shù)分鐘，即可獲得魚腎細(xì)胞懸液。取魚腎細(xì)胞懸液800r／min離心7min后，收集細(xì)胞，吹勻后加入預(yù)熱的0.075mol／L KCl溶液，37℃低滲處理30min～60min。經(jīng)低滲后的細(xì)胞吹勻后加固定液（甲醇∶冰醋酸=3∶1）固定30min，離心800r／min離心10min，重復(fù)固定2次。

1.2.2 滴片 將魚腎細(xì)胞懸液滴于預(yù)冷（4℃冰箱中預(yù)冷）載玻片上，每片1滴～2滴，自然干燥。染色待片干后，用100mL／L Giemsa液（pH 6.8，磷酸緩沖液配制）染色60min，用水充分沖洗，自然干燥后封片。1.2.3 染色體的觀察與計(jì)數(shù) 選取100個不同個體的魚腎細(xì)胞，經(jīng)顯微鏡進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)，確定染色體2n數(shù)目。在油鏡下觀察計(jì)數(shù)100個中期分裂相，在確定抗浪魚為二倍體的基礎(chǔ)上，選取10個左右進(jìn)行拍照、測量。

1.2.4 核型分析 首先目測照片上每條染色體長度，按長短順序初步編號，寫在每條染色體短臂的一端，同時(shí)確定主縊痕的位置，用分規(guī)和直尺逐條測量短臂和長臂長度。根據(jù)測量的數(shù)據(jù)，計(jì)算染色體的相對長度，臂比和著絲粒指數(shù)。

相對長度=（每個染色體的長度／全部染色體長度）×100

臂比（率）=長臂長度／短臂長度

著絲粒指數(shù)=（短臂長度／該染色體長度）×100

著絲粒的位置：一般來說，每條染色體著絲粒的位置是恒定的，染色體的兩臂常在著絲粒處呈不同程度的彎曲。著絲粒位置的測定常用的方法是以染色體的長臂（L）和短臂（S）的比值來表示（表1）。

表1 染色體著絲粒位置確定Table 1 The position of chromosome centromere

2 結(jié)果

2.1 抗浪魚的染色體二倍體數(shù)目

觀察并計(jì)數(shù)了抗浪魚的100個清晰的中期分裂相，其染色體分布見表2。

表中統(tǒng)計(jì)數(shù)字表明，抗浪魚的細(xì)胞染色體數(shù)目在46～50之間。染色體總數(shù)為48占75%，少于或多于48的染色體占25%。由此可以確定抗浪魚2n數(shù)為48，這同已報(bào)道的抗浪魚2n數(shù)一致。

2.2 抗浪魚的染色體核型

按Levan A等的標(biāo)準(zhǔn)對染色體進(jìn)行分類、命名，得到抗浪魚的染色體的相對長度、臂比、類型和著絲粒指數(shù)的數(shù)據(jù)（表3）。

表2 抗浪魚染色體數(shù)目Table 2 Chromosome number of Anabarilius grahami

表3 抗浪魚核型分析結(jié)果Table 3 The results of Anabarilius grahami karyotype

續(xù)表3

圖1 抗浪魚染色體中期分裂相Fig.1 The chromosome metaphase of Anabarilius grahami

3 討論

與其他魚類相比較，作為云南省重要的地方魚種，抗浪魚的分布不廣且受到了其他魚種的沖擊，再加上其種質(zhì)資源的研究開展也較少，并且研究也不夠系統(tǒng)，所以抗浪魚染色體組型的研究成果尚不多見、也不夠全面，因此抗浪魚的核型研究具有較大意義。

3.1 抗浪魚的核型

根據(jù)表3數(shù)據(jù)可把抗浪魚的染色體分為3類：A類（編號1～14）：共有染色體7對，都為中部著絲粒染色體。B類（編號15～34）：共有染色體10對，都為近中著絲粒染色體。C類（編號35～48）：共有染色體7對，都為近端著絲粒。因此，可以確定抗浪魚的核型公式為2n=14m＋20sm＋14st，染色體的總臂數(shù)NF=82。與安晶等［7］在抗浪魚的二倍體數(shù)目、核型公式和染色體的總臂數(shù)NF的研究結(jié)果一致，試驗(yàn)結(jié)果又一次確定了抗浪魚的核型，為抗浪魚的進(jìn)一步研究提供了依據(jù)。

圖2 抗浪魚染色體核型Fig.2 The karyotype of Anabarilius grahami

3.2 抗浪魚與其他鯉科魚類的核型比較

鲌亞科中的星云白魚（Anabarilius andersoni）、大鱗白魚（Anabarilius macrolepis）、取自杞麓湖的銀白魚（Anabarilius alburnops）、取自滇池的銀白魚（Anabarilius alburnops）、黑尾近紅鲌（Ancherythroculter nigrocauda）、海南華鳊（Sinibrama melrosei）、銀飄魚（Pseudolaubuca sinensis）、廣東魴（Megalobrama terminalis）的染色體總數(shù)是一致的，都是2n=48，而核型公式和染色體的總臂數(shù)NF變異范圍很大［8-10］。鲌亞科魚類和抗浪魚同屬鲌亞科的黑尾近紅鲌、海南華鳊、銀飄魚、廣東魴只有染色體總數(shù)與抗浪魚相同，在核型公式和染色體的總臂數(shù)NF方面的差距較大，表現(xiàn)出了較大的進(jìn)化差異性。與抗浪魚同屬鲌亞科白魚屬的星云白魚、大鱗白魚、銀白魚的染色體總數(shù)均為2n=48，與抗浪魚相同，但在核型公式和染色體的總臂數(shù)NF方面又與抗浪魚略微有所不同，展現(xiàn)出了抗浪魚在進(jìn)化上的獨(dú)特性，體現(xiàn)了不同環(huán)境給魚類進(jìn)化所帶來的不同影響；同時(shí)星云白魚、取自杞麓湖的銀白魚在染色體總數(shù)、核型公式、染色體的總臂數(shù)NF方面是極其相似的，體現(xiàn)它們在進(jìn)化上的同源性，這個結(jié)論與先前楊君興的報(bào)道中對這3種魚共有一個最晚近的共同祖先的論述相互印證。從研究結(jié)果來看，想要將核型分析的結(jié)果做為抗浪魚種資檢測的指標(biāo)是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，若能進(jìn)一步運(yùn)用染色體帶型分析技術(shù)、光譜核型SKY技術(shù)、分子核型分析技術(shù)對抗浪魚的染色體進(jìn)行研究，其結(jié)果將可能為提高抗浪魚的研究的準(zhǔn)確性提供更有力的輔助。

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